मायोसिन हेवी चेनच्या पलीकडे मानवी सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंची विषमता

nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझर आवृत्तीला मर्यादित CSS सपोर्ट आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही नवीनतम ब्राउझर आवृत्ती वापरण्याची शिफारस करतो (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमध्ये सुसंगतता मोड अक्षम करा). याव्यतिरिक्त, सतत सपोर्ट सुनिश्चित करण्यासाठी, ही साइट शैली आणि जावास्क्रिप्टपासून मुक्त असेल.
स्केलेटल स्नायू ही एक विषम ऊती आहे जी प्रामुख्याने मायोफायब्रिल्सपासून बनलेली असते, जी मानवांमध्ये सामान्यतः तीन प्रकारांमध्ये वर्गीकृत केली जाते: एक "स्लो" (प्रकार 1) आणि दोन "वेगवान" (प्रकार 2A आणि 2X). तथापि, पारंपारिक मायोफायब्रिल प्रकारांमधील आणि त्यांच्यातील विषमता अद्याप समजलेली नाही. आम्ही मानवी व्हॅस्टस लॅटरलिसमधील अनुक्रमे 1050 आणि 1038 वैयक्तिक मायोफायब्रिल्सवर ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटिओमिक दृष्टिकोन लागू केले. प्रोटिओमिक अभ्यासात पुरुषांचा समावेश होता आणि ट्रान्सक्रिप्टोमिक अभ्यासात 10 पुरुष आणि 2 महिलांचा समावेश होता. मायोसिन हेवी चेन आयसोफॉर्म्स व्यतिरिक्त, आम्ही बहुआयामी इंटरमायोफायब्रिल परिवर्तनशीलतेचे स्रोत म्हणून चयापचय प्रथिने, राइबोसोमल प्रथिने आणि सेल्युलर जंक्शनल प्रथिने ओळखली. शिवाय, स्लो आणि फास्ट फायबरच्या क्लस्टर्सची ओळख असूनही, आमचा डेटा सूचित करतो की प्रकार 2X तंतू इतर जलद-ट्विच तंतूंपासून फेनोटाइपिकपणे वेगळे करता येत नाहीत. शिवाय, नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये मायोफायबर फेनोटाइपचे वर्णन करण्यासाठी मायोसिन हेवी चेन-आधारित वर्गीकरण पुरेसे नाही. एकंदरीत, आमचा डेटा बहुआयामी मायोफायबर विषमता दर्शवितो, ज्यामध्ये मायोसिन हेवी चेन आयसोफॉर्म्सच्या पलीकडे विविधतेचे स्रोत आहेत.
पेशीय विषमता ही सर्व जैविक प्रणालींचे एक अंतर्निहित वैशिष्ट्य आहे, ज्यामुळे पेशी ऊती आणि पेशींच्या वेगवेगळ्या गरजा पूर्ण करण्यासाठी विशेषज्ञ बनतात. १. कंकाल स्नायू तंतू विषमतेचा पारंपारिक दृष्टिकोन असा आहे की मोटर न्यूरॉन्स मोटर युनिटमधील फायबर प्रकार परिभाषित करतात आणि फायबर प्रकार (म्हणजेच, मानवांमध्ये प्रकार १, प्रकार २ए आणि प्रकार २एक्स) मायोसिन हेवी चेन (MYH) आयसोफॉर्म्सच्या वैशिष्ट्यांद्वारे निर्धारित केला जातो. २. हे सुरुवातीला त्यांच्या pH ATPase अस्थिरतेवर आधारित होते, ३.४ आणि नंतर त्यांच्या MYH च्या आण्विक अभिव्यक्तीवर.५. तथापि, वेगवेगळ्या प्रमाणात अनेक MYH सह-अभिव्यक्त करणाऱ्या "मिश्रित" तंतूंची ओळख आणि त्यानंतरच्या स्वीकृतीसह, कंकाल स्नायू तंतूंना वेगळ्या फायबर प्रकारांऐवजी एक सातत्य म्हणून पाहिले जात आहे.६ असे असूनही, हे क्षेत्र अजूनही मायोफायबर वर्गीकरणासाठी प्राथमिक वर्गीकरणकर्ता म्हणून MYH वर खूप अवलंबून आहे, हा दृष्टिकोन कदाचित सुरुवातीच्या उंदीर अभ्यासांच्या मर्यादा आणि महत्त्वपूर्ण पूर्वाग्रहांनी प्रभावित आहे ज्यांचे MYH अभिव्यक्ती प्रोफाइल आणि फायबर प्रकारांची श्रेणी मानवांपेक्षा भिन्न आहे. २. वेगवेगळ्या मानवी कंकाल स्नायू प्रदर्शित होतात या वस्तुस्थितीमुळे परिस्थिती आणखी गुंतागुंतीची आहे. विविध प्रकारच्या तंतू.७ व्हॅस्टस लॅटरलिस हा एक मिश्रित स्नायू आहे ज्यामध्ये मध्यवर्ती (आणि म्हणून प्रतिनिधित्व करणारा) MYH अभिव्यक्ती प्रोफाइल आहे.७ शिवाय, त्याची नमुना घेण्याची सोय त्याला मानवांमध्ये सर्वात जास्त अभ्यासलेला स्नायू बनवते.
अशाप्रकारे, शक्तिशाली "ओमिक्स" साधनांचा वापर करून कंकाल स्नायू तंतूंच्या विविधतेचा निष्पक्ष तपास करणे महत्त्वाचे आहे परंतु आव्हानात्मक देखील आहे, अंशतः कंकाल स्नायू तंतूंच्या बहु-न्यूक्लिएटेड स्वरूपामुळे. तथापि, ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स8,9 आणि प्रोटिओमिक्स10 तंत्रज्ञानाने अलिकडच्या वर्षांत विविध तांत्रिक प्रगतीमुळे संवेदनशीलतेत क्रांती घडवून आणली आहे, ज्यामुळे सिंगल-फायबर रिझोल्यूशनवर कंकाल स्नायूंचे विश्लेषण करणे शक्य झाले आहे. परिणामी, सिंगल-फायबर विविधता आणि अ‍ॅट्रोफिक उत्तेजना आणि वृद्धत्वाला त्यांचा प्रतिसाद दर्शविण्यामध्ये लक्षणीय प्रगती झाली आहे11,12,13,14,15,16,17,18. महत्त्वाचे म्हणजे, या तांत्रिक प्रगतींमध्ये क्लिनिकल अनुप्रयोग आहेत, ज्यामुळे रोगाशी संबंधित डिसरेग्युलेशनचे अधिक तपशीलवार आणि अचूक वैशिष्ट्यीकरण शक्य होते. उदाहरणार्थ, सर्वात सामान्य वारसा मिळालेल्या स्नायू रोगांपैकी एक, नेमलाइन मायोपॅथीचे पॅथोफिजियोलॉजी (MIM 605355 आणि MIM 161800), जटिल आणि गोंधळात टाकणारे आहे.19,20 म्हणून, कंकाल स्नायू तंतूंच्या डिसरेग्युलेशनचे चांगले वैशिष्ट्यीकरण या रोगाच्या आपल्या समजुतीमध्ये महत्त्वपूर्ण प्रगती करू शकते.
मानवी बायोप्सी नमुन्यांमधून मॅन्युअली वेगळे करून आम्ही एका कंकाल स्नायू तंतूंचे ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटिओमिक विश्लेषण करण्यासाठी पद्धती विकसित केल्या आणि त्या हजारो तंतूंवर लागू केल्या, ज्यामुळे आम्हाला मानवी कंकाल स्नायू तंतूंच्या सेल्युलर विषमतेची तपासणी करता आली. या कामाच्या दरम्यान, आम्ही स्नायू तंतूंच्या ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटिओमिक फेनोटाइपिंगची शक्ती प्रदर्शित केली आणि इंटरफायबर परिवर्तनशीलतेचे महत्त्वपूर्ण स्रोत म्हणून चयापचय, राइबोसोमल आणि सेल्युलर जंक्शनल प्रथिने ओळखली. शिवाय, या प्रोटिओमिक वर्कफ्लोचा वापर करून, आम्ही एका कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये नेमाटोड मायोपॅथीची क्लिनिकल प्रासंगिकता दर्शविली, ज्यामुळे MYH वर आधारित फायबर प्रकारापासून स्वतंत्र नॉन-ऑक्सिडेटिव्ह तंतूंकडे समन्वित बदल दिसून आला.
मानवी सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या विषमतेची तपासणी करण्यासाठी, आम्ही एकल सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंचे ट्रान्सक्रिप्टोम आणि प्रोटीओम विश्लेषण सक्षम करण्यासाठी दोन कार्यप्रवाह विकसित केले (आकृती 1A आणि पूरक आकृती 1A). आम्ही नमुना साठवण आणि आरएनए आणि प्रथिने अखंडतेचे जतन करण्यापासून ते प्रत्येक दृष्टिकोनासाठी थ्रूपुट ऑप्टिमायझेशनपर्यंत अनेक पद्धतशीर पायऱ्या विकसित आणि ऑप्टिमायझ केल्या. ट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषणासाठी, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनच्या सुरुवातीच्या टप्प्यावर नमुना-विशिष्ट आण्विक बारकोड घालून हे साध्य केले गेले, ज्यामुळे कार्यक्षम डाउनस्ट्रीम प्रक्रियेसाठी 96 तंतू एकत्रित केले जाऊ शकले. पारंपारिक एकल-सेल दृष्टिकोनांच्या तुलनेत सखोल अनुक्रम (प्रति फायबर ±1 दशलक्ष वाचन) ने ट्रान्सक्रिप्टोम डेटा अधिक समृद्ध केला. 21 प्रोटीओमिक्ससाठी, आम्ही उच्च थ्रूपुट राखताना प्रोटीओम खोली ऑप्टिमायझ करण्यासाठी timsTOF मास स्पेक्ट्रोमीटरवर DIA-PASEF डेटा अधिग्रहणासह एकत्रित केलेला एक लहान क्रोमॅटोग्राफिक ग्रेडियंट (21 मिनिटे) वापरला. २२,२३ निरोगी सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या विषमतेचा तपास करण्यासाठी, आम्ही १४ निरोगी प्रौढ दात्यांकडून १,०५० वैयक्तिक तंतूंचे ट्रान्सक्रिप्टोम आणि ५ निरोगी प्रौढ दात्यांकडून १,०३८ तंतूंचे प्रोटीओम यांचे वैशिष्ट्यीकृत केले (पूरक तक्ता १). या पेपरमध्ये, या डेटासेटना अनुक्रमे १,०००-फायबर ट्रान्सक्रिप्टोम आणि प्रोटीओम असे संबोधले आहे. आमच्या दृष्टिकोनातून १,०००-फायबर ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक विश्लेषणांमध्ये एकूण २७,२३७ ट्रान्सक्रिप्ट आणि २,९८३ प्रथिने आढळली (आकृती १A, पूरक डेटासेट १-२). १,००० पेक्षा जास्त आढळलेल्या जीन्स आणि प्रति फायबर ५०% वैध मूल्यांसाठी ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक डेटासेट फिल्टर केल्यानंतर, ट्रान्सक्रिप्टोम आणि प्रोटीओममधील अनुक्रमे ९२५ आणि ९७४ तंतूंसाठी त्यानंतरचे बायोइन्फॉरमॅटिक्स विश्लेषण केले गेले. फिल्टरिंग केल्यानंतर, मर्यादित आंतर-व्यक्तिगत परिवर्तनशीलतेसह, प्रति फायबर सरासरी 4257 ± 1557 जनुके आणि 2015 ± 234 प्रथिने (सरासरी ± SD) आढळली (पूरक आकृती 1B–C, पूरक डेटासेट 3–4). तथापि, सहभागींमध्ये अंतर्गत-विषय परिवर्तनशीलता अधिक स्पष्ट होती, कदाचित वेगवेगळ्या लांबीच्या तंतू आणि क्रॉस-सेक्शनल क्षेत्रांमधील RNA/प्रथिने उत्पन्नातील फरकांमुळे. बहुतेक प्रथिनांसाठी (>2000), भिन्नतेचा गुणांक 20% पेक्षा कमी होता (पूरक आकृती 1D). दोन्ही पद्धतींनी स्नायूंच्या आकुंचनासाठी महत्त्वपूर्ण असलेल्या उच्च व्यक्त स्वाक्षऱ्यांसह ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि प्रथिनांची विस्तृत गतिमान श्रेणी कॅप्चर करण्यास अनुमती दिली (उदा., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) (पूरक आकृती 1E–F). बहुतेक ओळखल्या गेलेल्या वैशिष्ट्यांमध्ये ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक डेटासेटमध्ये समानता होती (पूरक आकृती 1G), आणि या वैशिष्ट्यांची सरासरी UMI/LFQ तीव्रता वाजवी प्रमाणात चांगल्या प्रकारे सहसंबंधित होती (r = 0.52) (पूरक आकृती 1H).
ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि प्रोटीओमिक्स वर्कफ्लो (BioRender.com सह तयार केलेले). MYH7, MYH2 आणि MYH1 साठी BD डायनॅमिक रेंज वक्र आणि फायबर प्रकार असाइनमेंटसाठी गणना केलेले थ्रेशोल्ड. ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि प्रोटीओमिक्स डेटासेटमध्ये फायबरमध्ये MYH अभिव्यक्तीचे E, F वितरण. G, H MYH-आधारित फायबर प्रकारानुसार रंगीत ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि प्रोटीओमिक्ससाठी एकसमान विविधता अंदाज आणि प्रोजेक्शन (UMAP) प्लॉट. I, J ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि प्रोटीओमिक्स डेटासेटमध्ये MYH7, MYH2 आणि MYH1 अभिव्यक्ती दर्शविणारे वैशिष्ट्यपूर्ण प्लॉट.
आम्ही सुरुवातीला प्रत्येक फायबरला MYH-आधारित फायबर प्रकार नियुक्त करण्याचा निर्णय घेतला जो ओमिक्स डेटासेटमध्ये MYH अभिव्यक्तीच्या उच्च संवेदनशीलता आणि गतिमान श्रेणीचा फायदा घेत एक ऑप्टिमाइझ केलेला दृष्टिकोन वापरून केला. मागील अभ्यासांमध्ये फायबरना शुद्ध प्रकार 1, प्रकार 2A, प्रकार 2X किंवा वेगवेगळ्या MYHs च्या अभिव्यक्तीच्या निश्चित टक्केवारीवर आधारित मिश्रित म्हणून लेबल करण्यासाठी अनियंत्रित थ्रेशोल्ड वापरले गेले आहेत11,14,24. आम्ही एक वेगळा दृष्टिकोन वापरला ज्यामध्ये प्रत्येक फायबरची अभिव्यक्ती आम्ही फायबर टाइप करण्यासाठी वापरलेल्या MYHs द्वारे क्रमवारी लावली गेली: MYH7, MYH2, आणि MYH1, अनुक्रमे प्रकार 1, प्रकार 2A आणि प्रकार 2X फायबरशी संबंधित. त्यानंतर आम्ही गणितीयरित्या प्रत्येक परिणामी वक्रच्या खालच्या वळण बिंदूची गणना केली आणि प्रत्येक MYH साठी फायबरना सकारात्मक (थ्रेशोल्डच्या वर) किंवा नकारात्मक (थ्रेशोल्डच्या खाली) म्हणून नियुक्त करण्यासाठी थ्रेशोल्ड म्हणून वापरला (आकृती 1B-D). या डेटावरून असे दिसून येते की MYH7 (आकृती 1B) आणि MYH2 (आकृती 1C) मध्ये प्रथिने पातळीच्या तुलनेत RNA पातळीवर अधिक वेगळे ऑन/ऑफ एक्सप्रेशन प्रोफाइल आहेत. खरंच, प्रथिने पातळीवर, खूप कमी तंतू MYH7 व्यक्त करत नव्हते आणि कोणत्याही फायबरमध्ये 100% MYH2 एक्सप्रेशन नव्हते. आम्ही पुढे प्रत्येक डेटासेटमधील सर्व तंतूंना MYH-आधारित फायबर प्रकार नियुक्त करण्यासाठी पूर्वनिर्धारित अभिव्यक्ती थ्रेशोल्ड वापरले. उदाहरणार्थ, MYH7+/MYH2-/MYH1- फायबर प्रकार 1 ला नियुक्त केले गेले होते, तर MYH7-/MYH2+/MYH1+ फायबर मिश्र प्रकार 2A/2X ला नियुक्त केले गेले होते (पूर्ण वर्णनासाठी पूरक तक्ता 2 पहा). सर्व तंतू एकत्रित करताना, आम्हाला RNA (आकृती 1E) आणि प्रथिने (आकृती 1F) दोन्ही स्तरांवर MYH-आधारित फायबर प्रकारांचे उल्लेखनीय समान वितरण आढळले, तर MYH-आधारित फायबर प्रकारांची सापेक्ष रचना अपेक्षेप्रमाणे व्यक्तींमध्ये भिन्न होती (पूरक आकृती 2A). बहुतेक तंतू शुद्ध प्रकार १ (३४-३५%) किंवा प्रकार २ए (३६-३८%) म्हणून वर्गीकृत केले गेले होते, जरी मिश्र प्रकार २ए/२एक्स तंतूंची लक्षणीय संख्या देखील आढळली (१६-१९%). एक उल्लेखनीय फरक असा आहे की शुद्ध प्रकार २एक्स तंतू केवळ आरएनए स्तरावर शोधले जाऊ शकतात, परंतु प्रथिने स्तरावर नाही, हे सूचित करते की जलद MYH अभिव्यक्ती किमान अंशतः ट्रान्सक्रिप्शननंतर नियंत्रित केली जाते.
आम्ही अँटीबॉडी-आधारित डॉट ब्लॉटिंग वापरून आमच्या प्रोटीओमिक्स-आधारित MYH फायबर टायपिंग पद्धतीचे प्रमाणीकरण केले आणि दोन्ही पद्धतींनी शुद्ध प्रकार 1 आणि प्रकार 2A तंतू ओळखण्यात 100% सहमती दर्शविली (पूरक आकृती 2B पहा). तथापि, प्रोटीओमिक्स-आधारित दृष्टिकोन अधिक संवेदनशील, मिश्रित तंतू ओळखण्यात आणि प्रत्येक फायबरमधील प्रत्येक MYH जनुकाचे प्रमाण निश्चित करण्यात अधिक कार्यक्षम होता. हे डेटा कंकाल स्नायू फायबर प्रकारांचे वैशिष्ट्यीकृत करण्यासाठी वस्तुनिष्ठ, अत्यंत संवेदनशील ओमिक्स-आधारित दृष्टिकोन वापरण्याची प्रभावीता दर्शवितात.
त्यानंतर आम्ही ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि प्रोटिओमिक्सने दिलेल्या एकत्रित माहितीचा वापर करून त्यांच्या संपूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम किंवा प्रोटिओमच्या आधारे मायोफायबरचे वस्तुनिष्ठपणे वर्गीकरण केले. सहा प्रमुख घटकांपर्यंत परिमाण कमी करण्यासाठी एकसमान मॅनिफोल्ड अ‍ॅप्रॉक्सिमेशन आणि प्रोजेक्शन (UMAP) पद्धतीचा वापर करून, आम्ही ट्रान्सक्रिप्टोम (आकृती 1G) आणि प्रोटिओम (आकृती 1H) मध्ये मायोफायबर परिवर्तनशीलता दृश्यमान करू शकलो. उल्लेखनीय म्हणजे, ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स किंवा प्रोटिओमिक्स डेटासेटमध्ये सहभागी (पूरक आकृती 3C-D) किंवा चाचणी दिवस (पूरक आकृती 3E) द्वारे मायोफायबरचे गट केले गेले नव्हते, जे सूचित करते की कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये विषयातील अंतर्गत परिवर्तनशीलता विषयातील परिवर्तनशीलतेपेक्षा जास्त आहे. UMAP प्लॉटमध्ये, "वेगवान" आणि "मंद" मायोफायबरचे प्रतिनिधित्व करणारे दोन वेगळे क्लस्टर उदयास आले (आकृती 1G-H). MYH7+ (स्लो) मायोफायबर UMAP1 च्या पॉझिटिव्ह ध्रुवावर क्लस्टर केले गेले होते, तर MYH2+ आणि MYH1+ (वेगवान) मायोफायबर UMAP1 च्या नकारात्मक ध्रुवावर क्लस्टर केले गेले होते (आकृती 1I-J). तथापि, MYH अभिव्यक्तीच्या आधारे फास्ट-ट्विच फायबर प्रकारांमध्ये (म्हणजेच प्रकार 2A, प्रकार 2X, किंवा मिश्रित 2A/2X) कोणताही फरक केला गेला नाही, जे सूचित करते की MYH1 (आकृती 1I-J) किंवा इतर शास्त्रीय 2X मायोफायबर मार्कर जसे की ACTN3 किंवा MYLK2 (पूरक आकृती 4A-B) अभिव्यक्ती संपूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम किंवा प्रोटीओम विचारात घेताना वेगवेगळ्या मायोफायबर प्रकारांमध्ये फरक करत नाही. शिवाय, MYH2 आणि MYH7 च्या तुलनेत, काही ट्रान्सक्रिप्ट किंवा प्रथिने MYH1 (पूरक आकृती 4C-H) शी सकारात्मकरित्या सहसंबंधित होती, असे सूचित करते की MYH1 ची विपुलता मायोफायबर ट्रान्सक्रिप्टोम/प्रोटिओम पूर्णपणे प्रतिबिंबित करत नाही. UMAP स्तरावर तीन MYH आयसोफॉर्म्सच्या मिश्र अभिव्यक्तीचे मूल्यांकन करताना समान निष्कर्ष काढण्यात आले (पूरक आकृती 4I–J). अशाप्रकारे, केवळ MYH परिमाणानुसार ट्रान्सक्रिप्ट स्तरावर 2X तंतू ओळखले जाऊ शकतात, परंतु संपूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम किंवा प्रोटीओमचा विचार करताना MYH1+ तंतू इतर जलद तंतूंपासून वेगळे करता येत नाहीत.
MYH च्या पलीकडे असलेल्या स्लो फायबर विषमतेचा प्रारंभिक शोध म्हणून, आम्ही चार स्थापित स्लो फायबर प्रकार-विशिष्ट प्रथिनेंचे मूल्यांकन केले: TPM3, TNNT1, MYL3, आणि ATP2A22. ट्रान्सक्रिप्टॉमिक्स (पूरक आकृती 5A) आणि प्रोटीओमिक्स (पूरक आकृती 5B) दोन्हीमध्ये स्लो फायबर उपप्रकारांनी MYH7 सोबत उच्च, जरी परिपूर्ण नसले तरी, पिअर्सन सहसंबंध दर्शविले. ट्रान्सक्रिप्टॉमिक्स (पूरक आकृती 5C) आणि प्रोटीओमिक्स (पूरक आकृती 5D) मध्ये अनुक्रमे सर्व जीन/प्रोटीन उपप्रकारांद्वारे अंदाजे 25% आणि 33% स्लो फायबर शुद्ध स्लो फायबर म्हणून वर्गीकृत केले गेले नाहीत. म्हणून, एकाधिक जीन/प्रोटीन उपप्रकारांवर आधारित स्लो फायबर वर्गीकरण फायबर प्रकार-विशिष्ट म्हणून ओळखल्या जाणाऱ्या प्रथिनांसाठी देखील अतिरिक्त जटिलता आणते. हे सूचित करते की एकाच जीन/प्रोटीन कुटुंबाच्या आयसोफॉर्मवर आधारित फायबर वर्गीकरण कंकाल स्नायू तंतूंची खरी विषमता पुरेसे प्रतिबिंबित करू शकत नाही.
संपूर्ण ओमिक्स मॉडेलच्या प्रमाणात मानवी सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या फेनोटाइपिक परिवर्तनशीलतेचा अधिक शोध घेण्यासाठी, आम्ही मुख्य घटक विश्लेषण (PCA) (आकृती 2A) वापरून डेटाचे निष्पक्ष आयाम कमी केले. UMAP प्लॉट्स प्रमाणेच, सहभागी किंवा चाचणी दिवसाने PCA स्तरावर फायबर क्लस्टरिंगवर प्रभाव पाडला नाही (पूरक आकृती 6A-C). दोन्ही डेटासेटमध्ये, MYH-आधारित फायबर प्रकार PC2 द्वारे स्पष्ट केला गेला होता, ज्यामध्ये स्लो-ट्विच प्रकार 1 फायबरचा क्लस्टर आणि फास्ट-ट्विच प्रकार 2A, प्रकार 2X आणि मिश्रित 2A/2X फायबर असलेले दुसरे क्लस्टर दर्शविले गेले (आकृती 2A). दोन्ही डेटासेटमध्ये, हे दोन क्लस्टर थोड्या प्रमाणात मिश्रित प्रकार 1/2A फायबरने जोडलेले होते. अपेक्षेप्रमाणे, मुख्य PC ड्रायव्हर्सच्या अति-प्रतिनिधित्त्व विश्लेषणाने पुष्टी केली की PC2 आकुंचनशील आणि चयापचय स्वाक्षरींद्वारे चालविले गेले होते (आकृती 2B आणि पूरक आकृती 6D-E, पूरक डेटासेट 5-6). एकंदरीत, MYH-आधारित फायबर प्रकार PC2 वर सतत भिन्नतेचे स्पष्टीकरण देण्यासाठी पुरेसे असल्याचे आढळून आले, तथाकथित 2X फायबर वगळता जे जलद क्लस्टरमध्ये ट्रान्सक्रिप्टोममध्ये वितरित केले गेले होते.
A. MYH वर आधारित फायबर प्रकारानुसार रंगीत ट्रान्सक्रिप्टोम आणि प्रोटीओम डेटासेटचे प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्लॉट. B. PC2 आणि PC1 मधील ट्रान्सक्रिप्ट आणि प्रोटीन ड्रायव्हर्सचे समृद्ध विश्लेषण. क्लस्टर प्रोफाइलर पॅकेज आणि बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित p-मूल्ये वापरून सांख्यिकीय विश्लेषण केले गेले. C, D. प्रोटीओममधील ट्रान्सक्रिप्टोम आणि कोस्टामेर GO टर्ममध्ये इंटरसेल्युलर अॅडहेसन जीन ऑन्टोलॉजी (GO) टर्मनुसार रंगीत PCA प्लॉट. बाण ट्रान्सक्रिप्ट आणि प्रोटीन ड्रायव्हर्स आणि त्यांच्या दिशानिर्देशांचे प्रतिनिधित्व करतात. E, F. युनिफॉर्म मॅनिफोल्ड अ‍ॅप्रॉक्सिमेशन अँड प्रोजेक्शन (UMAP) मध्ये क्लिनिकली संबंधित वैशिष्ट्यांचे प्लॉट आहेत जे स्लो/फास्ट फायबर प्रकारापासून स्वतंत्र अभिव्यक्ती ग्रेडियंट दर्शवितात. G, H. ट्रान्सक्रिप्टोम आणि प्रोटीओममध्ये PC2 आणि PC1 ड्रायव्हर्समधील सहसंबंध.
अनपेक्षितपणे, MYH-आधारित मायोफायबर प्रकाराने परिवर्तनशीलतेची दुसरी सर्वोच्च डिग्री (PC2) स्पष्ट केली, असे सूचित करते की MYH-आधारित मायोफायबर प्रकार (PC1) शी संबंधित नसलेले इतर जैविक घटक कंकाल स्नायू तंतूंच्या विषमतेचे नियमन करण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावतात. PC1 मधील शीर्ष ड्रायव्हर्सच्या अतिरेकी विश्लेषणातून असे दिसून आले की PC1 मधील परिवर्तनशीलता प्रामुख्याने ट्रान्सक्रिप्टोममधील सेल-सेल आसंजन आणि राइबोसोम सामग्री आणि प्रोटीओममधील कोस्टामेरेस आणि राइबोसोमल प्रथिने (आकृती 2B आणि पूरक आकृत्या 6D-E, पूरक डेटा सेट 7) द्वारे निर्धारित केली जाते. कंकाल स्नायूमध्ये, कोस्टामेरेस Z-डिस्कला सारकोलेमाशी जोडतात आणि फोर्स ट्रान्समिशन आणि सिग्नलिंगमध्ये गुंतलेले असतात. 25 सेल-सेल आसंजन (ट्रान्सक्रिप्टोम, आकृती 2C) आणि कोस्टामेरे (प्रोटिओम, आकृती 2D) वैशिष्ट्यांचा वापर करून भाष्य केलेल्या PCA प्लॉट्सने PC1 मध्ये एक मजबूत डावीकडे शिफ्ट उघड केली, जे दर्शवते की ही वैशिष्ट्ये विशिष्ट तंतूंमध्ये समृद्ध आहेत.
UMAP स्तरावर मायोफायबर क्लस्टरिंगच्या अधिक तपशीलवार तपासणीतून असे दिसून आले की बहुतेक वैशिष्ट्यांमध्ये मायोफायबर सबक्लस्टर-विशिष्ट नसून मायोफायबर प्रकार-स्वतंत्र MYH-आधारित अभिव्यक्ती ग्रेडियंट दिसून आला. ही सातत्यता पॅथॉलॉजिकल स्थितींशी संबंधित अनेक जनुकांसाठी (आकृती 2E), जसे की CHCHD10 (न्यूरोमस्क्युलर रोग), SLIT3 (स्नायू शोष), CTDNEP1 (स्नायू रोग) आढळली. ही सातत्यता प्रोटीओममध्ये देखील दिसून आली, ज्यामध्ये न्यूरोलॉजिकल डिसऑर्डरशी संबंधित प्रथिने (UGDH), इन्सुलिन सिग्नलिंग (PHIP) आणि ट्रान्सक्रिप्शन (HIST1H2AB) (आकृती 2F) समाविष्ट आहेत. एकत्रितपणे, हे डेटा वेगवेगळ्या मायोफायबरमध्ये फायबर प्रकार-स्वतंत्र मंद/जलद ट्विच विषमतेमध्ये सातत्य दर्शवितात.
मनोरंजक गोष्ट म्हणजे, PC2 मधील ड्रायव्हर जीन्सने चांगले ट्रान्सक्रिप्टोम-प्रोटिओम सहसंबंध (r = 0.663) (आकृती 2G) दर्शविले, जे सूचित करते की स्लो- आणि फास्ट-ट्विच फायबर प्रकार, आणि विशेषतः कंकाल स्नायू तंतूंचे आकुंचनशील आणि चयापचय गुणधर्म, ट्रान्सक्रिप्शनली नियंत्रित केले जातात. तथापि, PC1 मधील ड्रायव्हर जीन्सने ट्रान्सक्रिप्टोम-प्रोटिओम सहसंबंध (r = -0.027) (आकृती 2H) दर्शविले नाही, जे सूचित करते की स्लो/फास्ट-ट्विच फायबर प्रकारांशी संबंधित नसलेले फरक मोठ्या प्रमाणात पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनली नियंत्रित केले जातात. कारण PC1 मधील फरक प्रामुख्याने राइबोसोमल जीन ऑन्टोलॉजी संज्ञांद्वारे स्पष्ट केले गेले होते आणि राइबोसोम्स पेशीमध्ये प्रथिने भाषांतरात सक्रियपणे सहभागी होऊन आणि प्रभावित करून महत्त्वपूर्ण आणि विशेष भूमिका बजावतात, 31 आम्ही पुढे या अनपेक्षित राइबोसोमल विषमतेची तपासणी करण्यासाठी निघालो.
आम्ही प्रथम GOCC टर्म "सायटोप्लाज्मिक राइबोसोम" (आकृती 3A) मधील प्रथिनांच्या सापेक्ष विपुलतेनुसार प्रोटीओमिक्स मुख्य घटक विश्लेषण प्लॉट रंगवला. जरी हा टर्म PC1 च्या सकारात्मक बाजूने समृद्ध आहे, ज्यामुळे एक लहान ग्रेडियंट निर्माण होतो, तरी राइबोसोमल प्रथिने PC1 च्या दोन्ही दिशांना विभाजन चालवतात (आकृती 3A). PC1 च्या नकारात्मक बाजूने समृद्ध केलेल्या राइबोसोमल प्रथिने RPL18, RPS18 आणि RPS13 (आकृती 3B) समाविष्ट होत्या, तर RPL31, RPL35 आणि RPL38 (आकृती 3C) हे PC1 च्या सकारात्मक बाजूचे मुख्य चालक होते. मनोरंजक म्हणजे, RPL38 आणि RPS13 इतर ऊतींच्या तुलनेत कंकाल स्नायूंमध्ये उच्च प्रमाणात व्यक्त केले गेले होते (पूरक आकृती 7A). PC1 मधील हे विशिष्ट राइबोसोमल स्वाक्षरी ट्रान्सक्रिप्टोममध्ये (पूरक आकृती 7B) आढळले नाहीत, जे पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल रेग्युलेशन दर्शवितात.
A. प्रोटीओममध्ये सायटोप्लाज्मिक राइबोसोमल जीन ऑन्टोलॉजी (GO) संज्ञांनुसार रंगवलेला प्रिन्सिपल कंपोनंट अॅनालिसिस (PCA) प्लॉट. बाण PCA प्लॉटमध्ये प्रोटीन-मध्यस्थ भिन्नतेची दिशा दर्शवतात. रेषेची लांबी दिलेल्या प्रथिनासाठी प्रिन्सिपल कंपोनंट स्कोअरशी जुळते. B, C. RPS13 आणि RPL38 साठी PCA वैशिष्ट्य प्लॉट. D. सायटोप्लाज्मिक राइबोसोमल प्रथिनांचे अनसप्रिव्हाइज्ड हायरार्किकल क्लस्टरिंग विश्लेषण. E. कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये वेगवेगळ्या प्रमाणात असलेल्या राइबोसोमल प्रथिनांना हायलाइट करणारे 80S राइबोसोम (PDB: 4V6X) चे स्ट्रक्चरल मॉडेल. F. mRNA एक्झिट चॅनेलजवळ वेगवेगळ्या स्टोइचियोमेट्रीसह रिबोसोमल प्रथिने स्थानिकीकृत.
राइबोसोमल विषमता आणि स्पेशलायझेशनच्या संकल्पना यापूर्वी प्रस्तावित केल्या गेल्या आहेत, ज्यामध्ये विशिष्ट राइबोसोमल उप-लोकसंख्या (राइबोसोमल विषमता) ची उपस्थिती विशिष्ट mRNA ट्रान्सक्रिप्ट पूल 34 (राइबोसोमल स्पेशलायझेशन) च्या निवडक भाषांतराद्वारे वेगवेगळ्या ऊती 32 आणि पेशी 33 मध्ये प्रथिने भाषांतरावर थेट प्रभाव टाकू शकते. कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये सह-अभिव्यक्त केलेल्या राइबोसोमल प्रथिनांच्या उप-लोकसंख्या ओळखण्यासाठी, आम्ही प्रोटीओममधील राइबोसोमल प्रथिनांचे एक अप्रत्याशित श्रेणीबद्ध क्लस्टरिंग विश्लेषण केले (आकृती 3D, पूरक डेटा सेट 8). अपेक्षेप्रमाणे, राइबोसोमल प्रथिने MYH वर आधारित फायबर प्रकारानुसार क्लस्टर झाली नाहीत. तथापि, आम्ही राइबोसोमल प्रथिनांचे तीन वेगळे क्लस्टर ओळखले; पहिला क्लस्टर (राइबोसोमल_क्लस्टर_1) RPL38 सह सह-नियमित आहे आणि म्हणूनच सकारात्मक PC1 प्रोफाइल असलेल्या तंतूंमध्ये अभिव्यक्ती वाढली आहे. दुसरा क्लस्टर (राइबोसोमल_क्लस्टर_2) RPS13 सह सह-नियमित आहे आणि नकारात्मक PC1 प्रोफाइल असलेल्या तंतूंमध्ये वाढलेला आहे. तिसरा क्लस्टर (ribosomal_cluster_3) कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये समन्वित विभेदक अभिव्यक्ती दर्शवत नाही आणि त्याला "कोर" कंकाल स्नायू राइबोसोमल प्रथिने मानले जाऊ शकते. दोन्ही राइबोसोमल क्लस्टर्स 1 आणि 2 मध्ये राइबोसोमल प्रथिने आहेत जी पूर्वी पर्यायी भाषांतर नियंत्रित करतात (उदा., RPL10A, RPL38, RPS19, आणि RPS25) आणि विकासावर कार्यात्मक प्रभाव पाडतात (उदा., RPL10A, RPL38).34,35,36,37,38 PCA निकालांशी सुसंगत, तंतूंमध्ये या राइबोसोमल प्रथिनांचे निरीक्षण केलेले विषम प्रतिनिधित्व देखील सातत्य दर्शविते (पूरक आकृती 7C).
राइबोसोममधील विषम राइबोसोमल प्रथिनांचे स्थान दृश्यमान करण्यासाठी, आम्ही मानवी 80S राइबोसोम (प्रोटीन डेटा बँक: 4V6X) (आकृती 3E) चे स्ट्रक्चरल मॉडेल वापरले. वेगवेगळ्या राइबोसोमल क्लस्टर्सशी संबंधित राइबोसोमल प्रथिनांना वेगळे केल्यानंतर, त्यांची स्थाने जवळून संरेखित केली गेली नाहीत, ज्यामुळे असे सूचित होते की आमचा दृष्टिकोन राइबोसोमच्या काही प्रदेशांसाठी/अंशांसाठी समृद्धी प्रदान करण्यात अयशस्वी झाला. मनोरंजक म्हणजे, तथापि, क्लस्टर 2 मध्ये मोठ्या सबयूनिट प्रथिनांचे प्रमाण क्लस्टर 1 आणि 3 पेक्षा कमी होते (पूरक आकृती 7D). आम्ही पाहिले की कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये बदललेले स्टोइचियोमेट्री असलेले प्रथिने प्रामुख्याने राइबोसोम पृष्ठभागावर (आकृती 3E) स्थानिकीकृत होते, वेगवेगळ्या mRNA लोकसंख्येमध्ये अंतर्गत राइबोसोम एंट्री साइट (IRES) घटकांशी संवाद साधण्याच्या त्यांच्या क्षमतेशी सुसंगत होते, ज्यामुळे निवडक भाषांतर समन्वयित होते. 40, 41 शिवाय, कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये बदललेले स्टोइचियोमेट्री असलेले अनेक प्रथिने mRNA एक्झिट बोगदा (आकृती 3F) सारख्या कार्यात्मक क्षेत्रांजवळ स्थित होते, जे विशिष्ट पेप्टाइड्सच्या ट्रान्सलेशनल लांबी आणि अटकेचे निवडकपणे नियमन करतात. ४२ सारांशात, आमच्या डेटावरून असे दिसून येते की कंकाल स्नायू राइबोसोमल प्रथिनांचे स्टोइचियोमेट्री विषमता प्रदर्शित करते, ज्यामुळे कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये फरक होतो.
पुढे आम्ही फास्ट- आणि स्लो-ट्विच फायबर सिग्नेचर ओळखण्यासाठी आणि त्यांच्या ट्रान्सक्रिप्शनल रेग्युलेशनच्या यंत्रणा एक्सप्लोर करण्यासाठी निघालो. दोन डेटासेटमध्ये UMAP द्वारे परिभाषित केलेल्या फास्ट- आणि स्लो-ट्विच फायबर क्लस्टर्सची तुलना करताना (आकृती 1G-H आणि 4A-B), ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटिओमिक विश्लेषणांनी अनुक्रमे 1366 आणि 804 भिन्न प्रमाणात प्रचलित वैशिष्ट्ये ओळखली (आकृती 4A-B, पूरक डेटासेट 9-12). आम्ही सारकोमेरेस (उदा., ट्रोपोमायोसिन आणि ट्रोपोनिन), उत्तेजना-आकुंचन जोडणी (SERCA आयसोफॉर्म्स), आणि ऊर्जा चयापचय (उदा., ALDOA आणि CKB) शी संबंधित स्वाक्षरींमध्ये अपेक्षित फरक पाहिले. शिवाय, प्रथिने युबिक्विटिनेशनचे नियमन करणारे ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि प्रथिने जलद- आणि स्लो-ट्विच फायबरमध्ये (उदा., USP54, SH3RF2, USP28, आणि USP48) भिन्नपणे व्यक्त केले गेले (आकृती 4A-B). शिवाय, सूक्ष्मजीव प्रथिने जनुक RP11-451G4.2 (DWORF), जो पूर्वी मेंढ्यांच्या स्नायू तंतू प्रकारांमध्ये भिन्नपणे व्यक्त केला गेला आहे आणि हृदयाच्या स्नायूंमध्ये SERCA क्रियाकलाप वाढवतो, तो मंद कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये लक्षणीयरीत्या वाढला होता (आकृती 4A). त्याचप्रमाणे, वैयक्तिक फायबर पातळीवर, चयापचय-संबंधित लैक्टेट डिहायड्रोजनेज आयसोफॉर्म्स (LDHA आणि LDHB, आकृती 4C आणि पूरक आकृती 8A) सारख्या ज्ञात स्वाक्षऱ्यांमध्ये लक्षणीय फरक दिसून आला. 45,46 तसेच पूर्वी अज्ञात फायबर-प्रकार-विशिष्ट स्वाक्षऱ्यांमध्ये (जसे की IRX3, USP54, USP28, आणि DPYSL3) (आकृती 4C). ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक डेटासेट्स (पूरक आकृती 8B) मध्ये भिन्नपणे व्यक्त केलेल्या वैशिष्ट्यांचा एक महत्त्वपूर्ण ओव्हरलॅप होता, तसेच मुख्यतः सार्कोमेरे वैशिष्ट्यांच्या अधिक स्पष्ट भिन्न अभिव्यक्तीद्वारे चालणारा फोल्ड बदल सहसंबंध होता (पूरक आकृती 8C). उल्लेखनीय म्हणजे, काही स्वाक्षऱ्या (उदा. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) मध्ये केवळ प्रोटीओमिक स्तरावर मजबूत पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल नियमन दिसून आले आणि त्यात स्लो/फास्ट ट्विच फायबर प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ती प्रोफाइल होते (पूरक आकृती 8C).
आकृती 1G–H मध्ये युनिफॉर्म मॅनिफोल्ड अ‍ॅप्रॉक्सिमेशन आणि प्रोजेक्शन (UMAP) प्लॉट्सद्वारे ओळखल्या जाणाऱ्या स्लो आणि फास्ट क्लस्टर्सची तुलना करणारे A आणि B ज्वालामुखी प्लॉट्स. रंगीत ठिपके FDR < 0.05 वर लक्षणीयरीत्या भिन्न असलेले ट्रान्सक्रिप्ट किंवा प्रथिने दर्शवतात आणि गडद ठिपके लॉग चेंज > 1 वर लक्षणीयरीत्या भिन्न असलेले ट्रान्सक्रिप्ट किंवा प्रथिने दर्शवतात. बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित p मूल्ये (ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स) किंवा लिम्मा रेषीय मॉडेल पद्धतीसह अनुभवजन्य बायेसियन विश्लेषणासह DESeq2 वाल्ड चाचणी वापरून द्वि-मार्गी सांख्यिकीय विश्लेषण केले गेले आणि त्यानंतर अनेक तुलनांसाठी (प्रोटीओमिक्स) बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजन केले गेले. C स्लो आणि फास्ट फायबरमधील निवडलेल्या भिन्नपणे व्यक्त केलेल्या जीन्स किंवा प्रथिनांचे स्वाक्षरी प्लॉट. D लक्षणीयपणे भिन्नपणे व्यक्त केलेल्या ट्रान्सक्रिप्ट आणि प्रथिनांचे समृद्धीकरण विश्लेषण. ओव्हरलॅपिंग मूल्ये दोन्ही डेटासेटमध्ये समृद्ध केली जातात, ट्रान्सक्रिप्टोम मूल्ये केवळ ट्रान्सक्रिप्टोममध्ये समृद्ध केली जातात आणि प्रोटीओम मूल्ये केवळ प्रोटीओममध्ये समृद्ध केली जातात. बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित p-मूल्यांसह क्लस्टर प्रोफाइलर पॅकेज वापरून सांख्यिकीय विश्लेषण केले गेले. E. SCENIC द्वारे ओळखले जाणारे फायबर प्रकार-विशिष्ट ट्रान्सक्रिप्शन घटक SCENIC-व्युत्पन्न नियामक विशिष्टता स्कोअर आणि फायबर प्रकारांमधील विभेदक mRNA अभिव्यक्तीवर आधारित. F. स्लो आणि फास्ट फायबरमध्ये भिन्नपणे व्यक्त केलेल्या निवडलेल्या ट्रान्सक्रिप्शन घटकांचे प्रोफाइलिंग.
त्यानंतर आम्ही भिन्न प्रतिनिधित्व केलेल्या जीन्स आणि प्रथिनांचे अति-प्रतिनिधित्व विश्लेषण केले (आकृती 4D, पूरक डेटा सेट 13). दोन डेटासेटमधील भिन्न वैशिष्ट्यांसाठी मार्ग समृद्धीमुळे अपेक्षित फरक दिसून आला, जसे की फॅटी अॅसिड β-ऑक्सिडेशन आणि केटोन चयापचय प्रक्रिया (मंद तंतू), मायोफिलामेंट/स्नायू आकुंचन (अनुक्रमे जलद आणि मंद तंतू), आणि कार्बोहायड्रेट कॅटाबॉलिक प्रक्रिया (मंद तंतू). ग्लायकोजेन चयापचय नियंत्रित करण्यासाठी ओळखल्या जाणाऱ्या नियामक आणि उत्प्रेरक फॉस्फेटेस उपयुनिट्स (PPP3CB, PPP1R3D, आणि PPP1R3A) सारख्या वैशिष्ट्यांमुळे सेरीन/थ्रेओनिन प्रोटीन फॉस्फेटेस क्रियाकलाप देखील वेगवान तंतूंमध्ये वाढला होता (47) (पूरक आकृती 8D–E). जलद तंतूंनी समृद्ध केलेल्या इतर मार्गांमध्ये प्रोटीओममधील प्रक्रिया (P-) बॉडीज (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (पूरक आकृती 8F), संभाव्यतः पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल रेग्युलेशनमध्ये सहभागी (48) आणि ट्रान्सक्रिप्टोममध्ये ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर अ‍ॅक्टिव्हिटी (SREBF1, RXRG, RORA) (पूरक आकृती 8G) यांचा समावेश होता. स्लो फायबर ऑक्सिडोरेडक्टेस अ‍ॅक्टिव्हिटी (BDH1, DCXR, TXN2) (पूरक आकृती 8H), अमाइड बाइंडिंग (CPTP, PFDN2, CRYAB) (पूरक आकृती 8I), बाह्य पेशीय मॅट्रिक्स (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (पूरक आकृती 8J), आणि रिसेप्टर-लिगँड अ‍ॅक्टिव्हिटी (FNDC5, SPX, NENF) (पूरक आकृती 8K) मध्ये समृद्ध होते.
स्लो/फास्ट स्नायू फायबर प्रकार वैशिष्ट्यांमधील ट्रान्सक्रिप्शनल रेग्युलेशनमध्ये अधिक अंतर्दृष्टी मिळविण्यासाठी, आम्ही SCENIC49 (पूरक डेटा सेट 14) वापरून ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर एन्रिचमेंट विश्लेषण केले. जलद आणि मंद स्नायू तंतूंमध्ये अनेक ट्रान्सक्रिप्शन घटक लक्षणीयरीत्या समृद्ध झाले (आकृती 4E). यामध्ये MAFA सारखे ट्रान्सक्रिप्शन घटक समाविष्ट होते, जे पूर्वी जलद स्नायू तंतू विकासाशी जोडले गेले आहे,50 तसेच स्नायू फायबर प्रकार-विशिष्ट जीन प्रोग्रामशी पूर्वी संबंधित नसलेले अनेक ट्रान्सक्रिप्शन घटक. यापैकी, PITX1, EGR1 आणि MYF6 हे जलद स्नायू तंतूंमध्ये सर्वात समृद्ध ट्रान्सक्रिप्शन घटक होते (आकृती 4E). याउलट, ZSCAN30 आणि EPAS1 (ज्याला HIF2A म्हणूनही ओळखले जाते) हे स्लो स्नायू तंतूंमध्ये सर्वात समृद्ध ट्रान्सक्रिप्शन घटक होते (आकृती 4E). याच्याशी सुसंगत, MAFA जलद स्नायू तंतूंशी संबंधित UMAP प्रदेशात उच्च पातळीवर व्यक्त केले गेले, तर EPAS1 मध्ये विरुद्ध अभिव्यक्ती नमुना होता (आकृती 4F).
ज्ञात प्रथिने-कोडिंग जनुकांव्यतिरिक्त, असंख्य नॉन-कोडिंग आरएनए बायोटाइप आहेत जे मानवी विकास आणि रोगाच्या नियमनात सहभागी असू शकतात. 51, 52 ट्रान्सक्रिप्टोम डेटासेटमध्ये, अनेक नॉन-कोडिंग आरएनए फायबर प्रकार विशिष्टता प्रदर्शित करतात (आकृती 5A आणि पूरक डेटासेट 15), ज्यामध्ये LINC01405 समाविष्ट आहे, जे स्लो फायबरसाठी अत्यंत विशिष्ट आहे आणि माइटोकॉन्ड्रियल मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमध्ये स्नायूंमध्ये घट झाल्याचे नोंदवले गेले आहे. 53 याउलट, RP11-255P5.3, lnc-ERCC5-5 जनुकाशी संबंधित (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, जलद फायबर प्रकार विशिष्टता प्रदर्शित करते. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) आणि RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) दोन्ही कंकाल स्नायू विशिष्टता प्रदर्शित करतात (पूरक आकृती 9A–B) आणि त्यांच्या 1 Mb जीनोमिक परिसरात कोणतेही ज्ञात आकुंचनशील जनुके नाहीत, जे सूचित करते की ते शेजारच्या आकुंचनशील जनुके नियंत्रित करण्याऐवजी फायबर प्रकारांचे नियमन करण्यात विशेष भूमिका बजावतात. अनुक्रमे LINC01405 आणि RP11-255P5.3 च्या स्लो/फास्ट फायबर प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ती प्रोफाइलची पुष्टी RNAscope (आकृती 5B–C) वापरून करण्यात आली.
अ. नॉन-कोडिंग आरएनए ट्रान्सक्रिप्ट्स स्लो- आणि फास्ट-ट्विच स्नायू तंतूंमध्ये लक्षणीयरीत्या नियंत्रित केले जातात. ब. LINC01405 आणि RP11-255P5.3 ची स्लो- आणि फास्ट-ट्विच फायबर प्रकार विशिष्टता दर्शविणारी प्रतिनिधी आरएनएस्कोप प्रतिमा. स्केल बार = 50 μm. क. आरएनएस्कोपद्वारे निर्धारित केल्यानुसार मायोफायबर प्रकार-विशिष्ट नॉन-कोडिंग आरएनए अभिव्यक्तीचे परिमाणीकरण (n = 3 स्वतंत्र व्यक्तींकडून बायोप्सी, प्रत्येक व्यक्तीमधील जलद आणि मंद स्नायू तंतूंची तुलना करणे). दोन-पुच्छ विद्यार्थ्यांच्या टी-टेस्टचा वापर करून सांख्यिकीय विश्लेषण केले गेले. बॉक्स प्लॉटमध्ये मध्यक आणि पहिला आणि तिसरा चतुर्थांश दर्शविला जातो, ज्यामध्ये व्हिस्कर्स किमान आणि कमाल मूल्यांकडे निर्देशित करतात. द. डी नोवो मायक्रोबियल प्रोटीन आयडेंटिफिकेशन वर्कफ्लो (BioRender.com सह तयार केलेले). E. सूक्ष्मजीव प्रथिने LINC01405_ORF408:17441:17358 विशेषतः मंद कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये व्यक्त केली जातात (स्वतंत्र सहभागींकडून n=5 बायोप्सी, प्रत्येक सहभागीमधील जलद आणि मंद स्नायू तंतूंची तुलना). सांख्यिकीय विश्लेषण लिम रेषीय मॉडेल पद्धतीचा वापर करून अनुभवजन्य बायेसियन दृष्टिकोनासह एकत्रित केले गेले, त्यानंतर p-मूल्य समायोजनासह अनेक तुलनांसाठी बेंजामिनी-होचबर्ग पद्धत वापरली गेली. बॉक्स प्लॉट मध्यक, पहिला आणि तिसरा चतुर्थांश दर्शवितात, ज्यामध्ये व्हिस्कर्स कमाल/किमान मूल्यांकडे निर्देशित करतात.
अलिकडेच, अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की अनेक कथित नॉन-कोडिंग ट्रान्सक्रिप्ट्स लिप्यंतरित सूक्ष्मजीव प्रथिने एन्कोड करतात, ज्यापैकी काही स्नायूंच्या कार्याचे नियमन करतात. 44, 55 संभाव्य फायबर प्रकार विशिष्टतेसह सूक्ष्मजीव प्रथिने ओळखण्यासाठी, आम्ही 1000 फायबर ट्रान्सक्रिप्टोम डेटासेट (आकृती 5D) मध्ये आढळलेल्या नॉन-कोडिंग ट्रान्सक्रिप्ट्स (n = 305) च्या अनुक्रमांसह कस्टम FASTA फाइल वापरून आमचा 1000 फायबर प्रोटीओम डेटासेट शोधला. आम्ही 22 वेगवेगळ्या ट्रान्सक्रिप्ट्समधून 197 सूक्ष्मजीव प्रथिने ओळखली, त्यापैकी 71 मंद आणि जलद कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये भिन्नपणे नियंत्रित केली गेली (पूरक आकृती 9C आणि पूरक डेटा सेट 16). LINC01405 साठी, तीन सूक्ष्मजीव प्रथिने उत्पादने ओळखली गेली, ज्यापैकी एकाने त्याच्या ट्रान्सक्रिप्टसारखीच मंद फायबर विशिष्टता दर्शविली (आकृती 5E आणि पूरक आकृती 9D). अशा प्रकारे, आम्ही LINC01405 ला मंद कंकाल स्नायू तंतूंसाठी विशिष्ट सूक्ष्मजीव प्रथिने एन्कोड करणारे जीन म्हणून ओळखले.
आम्ही वैयक्तिक स्नायू तंतूंचे मोठ्या प्रमाणात प्रोटीओमिक वैशिष्ट्यीकरण आणि निरोगी अवस्थेत फायबर विषमतेचे नियामक ओळखले जाण्यासाठी एक व्यापक कार्यप्रवाह विकसित केला. नेमलाइन मायोपॅथी कंकाल स्नायू तंतू विषमतेवर कसा परिणाम करतात हे समजून घेण्यासाठी आम्ही हा कार्यप्रवाह वापरला. नेमलाइन मायोपॅथी हे वारशाने मिळालेले स्नायू रोग आहेत ज्यामुळे स्नायू कमकुवत होतात आणि प्रभावित मुलांमध्ये, श्वसनाचा त्रास, स्कोलियोसिस आणि मर्यादित अवयव गतिशीलता यासारख्या विविध गुंतागुंती असतात. १९,२० सामान्यतः, नेमलाइन मायोपॅथीमध्ये, अ‍ॅक्टिन अल्फा १ (ACTA1) सारख्या जनुकांमधील रोगजनक प्रकारांमुळे स्लो-ट्विच फायबर मायोफायबर रचनेचे प्राबल्य होते, जरी हा परिणाम विषम असतो. एक उल्लेखनीय अपवाद म्हणजे ट्रोपोनिन T1 नेमलाइन मायोपॅथी (TNNT1), ज्यामध्ये जलद तंतूंचे प्राबल्य आहे. अशाप्रकारे, नेमलाइन मायोपॅथीमध्ये आढळणाऱ्या कंकाल स्नायू तंतूंच्या विकृतीच्या अंतर्निहित विषमतेची चांगली समज या रोग आणि मायोफायबर प्रकारातील जटिल संबंध उलगडण्यास मदत करू शकते.
निरोगी नियंत्रणांच्या तुलनेत (n=3 प्रति गट), ACTA1 आणि TNNT1 जनुकांमध्ये उत्परिवर्तन असलेल्या नेमलाइन मायोपॅथी रुग्णांपासून वेगळे केलेल्या मायोफायबरमध्ये चिन्हांकित मायोफायबर अ‍ॅट्रोफी किंवा डिस्ट्रोफी दिसून आली (आकृती 6A, पूरक तक्ता 3). उपलब्ध सामग्रीच्या मर्यादित प्रमाणामुळे प्रोटिओमिक विश्लेषणासाठी यामुळे महत्त्वपूर्ण तांत्रिक आव्हाने निर्माण झाली. असे असूनही, आम्ही 272 कंकाल मायोफायबरमध्ये 2485 प्रथिने शोधू शकलो. प्रति फायबर किमान 1000 प्रमाणित प्रथिने फिल्टर केल्यानंतर, 250 तंतूंचे त्यानंतरच्या बायोइन्फॉरमॅटिक्स विश्लेषणाच्या अधीन केले गेले. फिल्टर केल्यानंतर, प्रति फायबर सरासरी 1573 ± 359 प्रथिने प्रमाणित केली गेली (पूरक आकृती 10A, पूरक डेटा सेट 17-18). उल्लेखनीय म्हणजे, फायबर आकारात लक्षणीय घट असूनही, नेमलाइन मायोपॅथी रुग्णांच्या नमुन्यांची प्रोटीओम खोली केवळ माफक प्रमाणात कमी झाली. शिवाय, आमच्या स्वतःच्या FASTA फायली (नॉन-कोडिंग ट्रान्सक्रिप्टसह) वापरून या डेटावर प्रक्रिया केल्याने आम्हाला नेमलाइन मायोपॅथी रुग्णांमधील कंकाल मायोफायबर्समध्ये पाच सूक्ष्मजीव प्रथिने ओळखता आली (पूरक डेटा सेट 19). प्रोटीओमची गतिमान श्रेणी लक्षणीयरीत्या विस्तृत होती आणि नियंत्रण गटातील एकूण प्रथिने मागील 1000-फायबर प्रोटीओम विश्लेषणाच्या निकालांशी चांगल्या प्रकारे संबंधित होती (पूरक आकृती 10B-C).
A. ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीज (NM) मध्ये MYH वर आधारित फायबर अ‍ॅट्रोफी किंवा डिस्ट्रोफी आणि वेगवेगळ्या फायबर प्रकारांचे प्राबल्य दर्शविणारी सूक्ष्म प्रतिमा. स्केल बार = 100 μm. ACTA1 आणि TNNT1 रुग्णांमध्ये स्टेनिंगची पुनरुत्पादनक्षमता सुनिश्चित करण्यासाठी, प्रतिनिधी प्रतिमा निवडण्यापूर्वी तीन रुग्ण बायोप्सी दोन ते तीन वेळा (प्रत्येक केसमध्ये चार विभाग) रंगवल्या गेल्या. B. MYH वर आधारित सहभागींमध्ये फायबर प्रकार प्रमाण. C. नेमालाइन मायोपॅथीज आणि नियंत्रणे असलेल्या रुग्णांमध्ये कंकाल स्नायू तंतूंचा प्रमुख घटक विश्लेषण (PCA) प्लॉट. D. आकृती 2 मध्ये विश्लेषण केलेल्या 1000 तंतूंमधून निर्धारित केलेल्या PCA प्लॉटवर प्रक्षेपित केलेल्या नेमलाइन मायोपॅथीज आणि नियंत्रणे असलेल्या रुग्णांमधील कंकाल स्नायू तंतू. उदाहरणार्थ, ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीज आणि नियंत्रणे असलेल्या सहभागींमधील फरकांची तुलना करणारे ज्वालामुखी प्लॉट. रंगीत वर्तुळे π < 0.05 वर लक्षणीयरीत्या भिन्न असलेल्या प्रथिनांना दर्शवितात आणि गडद ठिपके एफडीआर < 0.05 वर लक्षणीयरीत्या भिन्न असलेल्या प्रथिनांना दर्शवितात. सांख्यिकीय विश्लेषण लिम्मा रेषीय मॉडेल पद्धत आणि अनुभवजन्य बायेसियन पद्धती वापरून केले गेले, त्यानंतर बेंजामिनी-होचबर्ग पद्धतीचा वापर करून अनेक तुलनांसाठी पी-मूल्य समायोजन केले गेले. एच. संपूर्ण प्रोटीओममध्ये आणि प्रकार 1 आणि 2A तंतूंमध्ये लक्षणीयरीत्या भिन्नतेने व्यक्त केलेल्या प्रथिनांचे समृद्धीकरण विश्लेषण. क्लस्टर प्रोफाइलर पॅकेज आणि बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित पी-मूल्ये वापरून सांख्यिकीय विश्लेषण केले गेले. आय, जे. प्रिन्सिपल कंपोनंट विश्लेषण (पीसीए) प्लॉट बाह्य पेशीय मॅट्रिक्स आणि माइटोकॉन्ड्रियल जीन ऑन्टोलॉजी (GO) संज्ञांद्वारे रंगवले गेले.
कारण नेमलाइन मायोपॅथी कंकाल स्नायूंमध्ये MYH-अभिव्यक्त करणाऱ्या मायोफायबर प्रकारांच्या प्रमाणात प्रभाव टाकू शकतात, १९,२० आम्ही प्रथम नेमलाइन मायोपॅथी आणि नियंत्रण असलेल्या रुग्णांमध्ये MYH-अभिव्यक्त करणाऱ्या मायोफायबर प्रकारांचे परीक्षण केले. आम्ही १००० मायोफायबर परख (पूरक आकृती १०D–E) साठी पूर्वी वर्णन केलेल्या निष्पक्ष पद्धतीचा वापर करून मायोफायबर प्रकार निश्चित केला आणि पुन्हा शुद्ध २X मायोफायबर ओळखण्यात अयशस्वी झालो (आकृती ६B). मायोफायबर प्रकारावर नेमलाइन मायोपॅथीचा विषम परिणाम आम्हाला दिसून आला, कारण ACTA1 उत्परिवर्तन असलेल्या दोन रुग्णांमध्ये टाइप १ मायोफायबरचे प्रमाण वाढले होते, तर TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या दोन रुग्णांमध्ये टाइप १ मायोफायबरचे प्रमाण कमी झाले होते (आकृती ६B). खरंच, ACTA1-नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये MYH2 आणि जलद ट्रोपोनिन आयसोफॉर्म्स (TNNC2, TNNI2, आणि TNNT3) ची अभिव्यक्ती कमी झाली, तर TNNT1-नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये MYH7 अभिव्यक्ती कमी झाली (पूरक आकृती 11A). हे नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये विषम मायोफायबर प्रकार स्विचिंगच्या मागील अहवालांशी सुसंगत आहे.19,20 आम्ही इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीद्वारे या निकालांची पुष्टी केली आणि आढळले की ACTA1-नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमध्ये टाइप 1 मायोफायबर्सचे प्राबल्य होते, तर TNNT1-नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमध्ये उलट नमुना होता (आकृती 6A).
सिंगल-फायबर प्रोटीओम पातळीवर, ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी रुग्णांमधील कंकाल स्नायू तंतू बहुतेक नियंत्रण तंतूंसह एकत्रित होते, ज्यामध्ये TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी तंतू सामान्यतः सर्वात गंभीरपणे प्रभावित होतात (आकृती 6C). प्रत्येक रुग्णासाठी स्यूडो-फुगवलेल्या तंतूंचे प्रिन्सिपल कंपोनंट विश्लेषण (PCA) प्लॉट प्लॉट करताना हे विशेषतः स्पष्ट होते, TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी रुग्ण 2 आणि 3 नियंत्रण नमुन्यांपासून सर्वात दूर असल्याचे दिसून आले (पूरक आकृती 11B, पूरक डेटा सेट 20). मायोपॅथी रुग्णांमधील तंतू निरोगी तंतूंशी कसे तुलना करतात हे चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी, आम्ही निरोगी प्रौढ सहभागींकडून 1,000 तंतूंच्या प्रोटीओमिक विश्लेषणातून मिळवलेल्या तपशीलवार माहितीचा वापर केला. आम्ही मायोपॅथी डेटासेट (ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी रुग्ण आणि नियंत्रणे) मधील तंतू 1000-फायबर प्रोटीओमिक विश्लेषण (आकृती 6D) मधून मिळवलेल्या PCA प्लॉटवर प्रक्षेपित केले. नियंत्रण तंतूंमध्ये PC2 सोबत MYH फायबर प्रकारांचे वितरण 1000-फायबर प्रोटिओमिक विश्लेषणातून मिळालेल्या फायबर वितरणासारखेच होते. तथापि, नेमालाइन मायोपॅथीच्या रुग्णांमध्ये बहुतेक तंतू PC2 खाली सरकले, निरोगी फास्ट-ट्विच फायबरसह ओव्हरलॅप झाले, त्यांचा मूळ MYH फायबर प्रकार काहीही असो. अशाप्रकारे, ACTA1 नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमध्ये MYH-आधारित पद्धती वापरून प्रमाणित केल्यावर टाइप 1 फायबरकडे बदल दिसून आला, तरीही ACTA1 नेमालाइन मायोपॅथी आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी या दोन्हींनी कंकाल स्नायू फायबर प्रोटीओमला फास्ट-ट्विच फायबरकडे हलवले.
त्यानंतर आम्ही प्रत्येक रुग्ण गटाची थेट निरोगी नियंत्रणांशी तुलना केली आणि अनुक्रमे ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये 256 आणि 552 भिन्न व्यक्त प्रथिने ओळखली (आकृती 6E-G आणि पूरक आकृती 11C, पूरक डेटा सेट 21). जीन समृद्धी विश्लेषणातून मायटोकॉन्ड्रियल प्रथिनांमध्ये समन्वित घट दिसून आली (आकृती 6H-I, पूरक डेटा सेट 22). आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये फायबर प्रकारांचे भिन्न प्राबल्य असूनही, ही घट MYH-आधारित फायबर प्रकारापेक्षा पूर्णपणे स्वतंत्र होती (आकृती 6H आणि पूरक आकृती 11D-I, पूरक डेटा सेट 23). ACTA1 किंवा TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये तीन सूक्ष्मजीव प्रथिने देखील नियंत्रित केली गेली. यापैकी दोन सूक्ष्मप्रथिने, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (ज्याला LINC00598 किंवा Lnc-FOXO1 असेही म्हणतात) आणि ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), यांनी फक्त प्रकार 1 मायोफायबर्समध्ये विभेदक विपुलता दर्शविली. ENSG00000215483_TR14_ORF67 पूर्वी पेशी चक्र नियमनात भूमिका बजावत असल्याचे नोंदवले गेले आहे. 56 दुसरीकडे, निरोगी नियंत्रणांच्या तुलनेत ACTA1-नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 शी संबंधित) प्रकार 1 आणि प्रकार 2A मायोफायबर्समध्ये वाढले होते (पूरक आकृती 12A, पूरक डेटा सेट 24). याउलट, राइबोसोमल प्रथिने मोठ्या प्रमाणात नेमलाइन मायोपॅथीमुळे प्रभावित झाली नाहीत, जरी ACTA1 नेमलाइन मायोपॅथीमध्ये RPS17 कमी नियंत्रित होते (आकृती 6E).
संवर्धन विश्लेषणातून ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये रोगप्रतिकारक प्रणाली प्रक्रियांचे अपरेग्युलेशन देखील दिसून आले, तर TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये पेशींचे आसंजन देखील वाढले होते (आकृती 6H). या बाह्य पेशी घटकांचे संवर्धन हे बाह्य पेशीय मॅट्रिक्स प्रथिनांनी PC1 आणि PC2 मध्ये PCA नकारात्मक दिशेने (म्हणजेच, सर्वात प्रभावित तंतूंकडे) हलवून प्रतिबिंबित केले (आकृती 6J). दोन्ही रुग्ण गटांनी रोगप्रतिकारक प्रतिक्रियांमध्ये आणि सारकोलेमल दुरुस्ती यंत्रणेमध्ये सहभागी असलेल्या बाह्य पेशीय प्रथिनांची वाढलेली अभिव्यक्ती दर्शविली, जसे की अॅनेक्सिन्स (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 आणि त्यांचे परस्परसंवादी प्रथिने S100A1159 (पूरक आकृती 12B-C). ही प्रक्रिया पूर्वी स्नायूंच्या डिस्ट्रोफीमध्ये वाढल्याचे नोंदवले गेले आहे60 परंतु, आमच्या माहितीनुसार, पूर्वी नेमालाइन मायोपॅथीशी संबंधित नव्हती. दुखापतीनंतर सारकोलेमल दुरुस्तीसाठी आणि मायोफायबरसह नव्याने तयार झालेल्या मायोसाइट्सचे संलयन करण्यासाठी या आण्विक यंत्रणेचे सामान्य कार्य आवश्यक आहे58,61. अशाप्रकारे, दोन्ही रुग्ण गटांमध्ये या प्रक्रियेची वाढलेली क्रिया मायोफायबर अस्थिरतेमुळे झालेल्या दुखापतीला पुनर्प्राप्ती प्रतिसाद सूचित करते.
प्रत्येक नेमलाइन मायोपॅथीचे परिणाम चांगले सहसंबंधित होते (r = 0.736) आणि वाजवी ओव्हरलॅप दर्शविते (पूरक आकृती 11A–B), जे दर्शविते की ACTA1 आणि TNNT1 नेमलाइन मायोपॅथीचे प्रोटीओमवर समान परिणाम होतात. तथापि, काही प्रथिने फक्त ACTA1 किंवा TNNT1 नेमलाइन मायोपॅथीमध्ये नियंत्रित केली गेली (पूरक आकृती 11A आणि C). प्रोफिब्रोटिक प्रोटीन MFAP4 हे TNNT1 नेमलाइन मायोपॅथीमधील सर्वात अपरेग्युलेटेड प्रथिनांपैकी एक होते परंतु ACTA1 नेमलाइन मायोपॅथीमध्ये ते अपरिवर्तित राहिले. HOX जीन ट्रान्सक्रिप्शनचे नियमन करण्यासाठी जबाबदार असलेल्या PAF1C कॉम्प्लेक्सचा एक घटक SKIC8, TNNT1 नेमलाइन मायोपॅथीमध्ये कमी नियमन केले गेले परंतु ACTA1 नेमलाइन मायोपॅथीमध्ये त्याचा परिणाम झाला नाही (पूरक आकृती 11A). ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीची थेट तुलना केल्याने TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये मायटोकॉन्ड्रियल प्रथिनांमध्ये जास्त घट आणि रोगप्रतिकारक प्रणाली प्रथिनांमध्ये वाढ दिसून आली (आकृती 6G-H आणि पूरक आकृती 11C आणि 11H-I). हे डेटा TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी (आकृती 6A) च्या तुलनेत TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये आढळलेल्या मोठ्या शोष/डिस्ट्रॉफीशी सुसंगत आहेत, जे सूचित करते की TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी रोगाचे अधिक गंभीर स्वरूप दर्शवते.
संपूर्ण स्नायूंच्या पातळीवर नेमलाइन मायोपॅथीचे निरीक्षण केलेले परिणाम टिकून राहतात की नाही हे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही TNNT1 नेमलाइन मायोपॅथी रुग्णांच्या त्याच गटातील स्नायू बायोप्सीचे बल्क प्रोटिओमिक विश्लेषण केले आणि त्यांची तुलना नियंत्रणांशी केली (प्रति गट n=3) (पूरक आकृती 13A, पूरक डेटा सेट 25). अपेक्षेप्रमाणे, मुख्य घटक विश्लेषणात नियंत्रणे जवळून संबंधित होती, तर TNNT1 नेमलाइन मायोपॅथी रुग्णांनी सिंगल फायबर विश्लेषणात (पूरक आकृती 13B) दिसून आलेल्या सारख्या उच्च इंटरसॅम्पल परिवर्तनशीलता दर्शविली. बल्क विश्लेषणाने वैयक्तिक तंतूंची तुलना करून हायलाइट केलेल्या भिन्न व्यक्त प्रथिने (पूरक आकृती 13C, पूरक डेटा सेट 26) आणि जैविक प्रक्रिया (पूरक आकृती 13D, पूरक डेटा सेट 27) पुनरुत्पादित केल्या, परंतु वेगवेगळ्या फायबर प्रकारांमध्ये फरक करण्याची क्षमता गमावली आणि तंतूंमध्ये विषम रोग प्रभावांचा हिशेब देण्यात अयशस्वी झाले.
एकत्रितपणे, हे डेटा दर्शविते की सिंगल-मायोफायबर प्रोटीओमिक्स क्लिनिकल जैविक वैशिष्ट्ये स्पष्ट करू शकतात जी इम्युनोब्लोटिंगसारख्या लक्ष्यित पद्धतींद्वारे शोधता येत नाहीत. शिवाय, हे डेटा फेनोटाइपिक अनुकूलनाचे वर्णन करण्यासाठी केवळ अ‍ॅक्टिन फायबर टायपिंग (MYH) वापरण्याच्या मर्यादांवर प्रकाश टाकतात. खरंच, अ‍ॅक्टिन आणि ट्रोपोनिन नेमलाइन मायोपॅथीमध्ये फायबर प्रकार स्विचिंग वेगळे असले तरी, दोन्ही नेमलाइन मायोपॅथी MYH फायबर टायपिंगला कंकाल स्नायू फायबर चयापचयातून वेगवान आणि कमी ऑक्सिडेटिव्ह स्नायू प्रोटीओमकडे वेगळे करतात.
ऊतींना त्यांच्या विविध मागण्या पूर्ण करण्यासाठी पेशीय विषमता अत्यंत महत्त्वाची असते. सांगाड्याच्या स्नायूंमध्ये, याला अनेकदा फायबर प्रकार म्हणून वर्णन केले जाते ज्यामध्ये वेगवेगळ्या प्रमाणात शक्ती उत्पादन आणि थकवा येतो. तथापि, हे स्पष्ट आहे की हे सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या परिवर्तनशीलतेचा फक्त एक छोटासा भाग स्पष्ट करते, जो पूर्वी विचार केला होता त्यापेक्षा खूपच परिवर्तनशील, गुंतागुंतीचा आणि बहुआयामी आहे. तांत्रिक प्रगतीमुळे आता सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंचे नियमन करणाऱ्या घटकांवर प्रकाश पडला आहे. खरंच, आमचा डेटा सूचित करतो की टाइप 2X फायबर हा एक वेगळा सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंचा उपप्रकार असू शकत नाही. शिवाय, आम्ही चयापचय प्रथिने, राइबोसोमल प्रथिने आणि पेशी-संबंधित प्रथिने कंकाल स्नायू तंतूंच्या विषमतेचे प्रमुख निर्धारक म्हणून ओळखले. नेमाटोड मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांच्या नमुन्यांवर आमचा प्रोटीओमिक वर्कफ्लो लागू करून, आम्ही पुढे दाखवून दिले की MYH-आधारित फायबर टायपिंग कंकाल स्नायू विषमतेचे पूर्णपणे प्रतिबिंबित करत नाही, विशेषतः जेव्हा सिस्टम विचलित असते. खरंच, MYH-आधारित फायबर प्रकार काहीही असो, नेमाटोड मायोपॅथीमुळे जलद आणि कमी ऑक्सिडेटिव्ह तंतूंकडे वळण होते.
१९ व्या शतकापासून कंकाल स्नायू तंतूंचे वर्गीकरण केले जात आहे. अलीकडील ओमिक्स विश्लेषणांमुळे आम्हाला वेगवेगळ्या MYH फायबर प्रकारांचे अभिव्यक्ती प्रोफाइल आणि वेगवेगळ्या उत्तेजनांना त्यांचे प्रतिसाद समजून घेण्यास सुरुवात झाली आहे. येथे वर्णन केल्याप्रमाणे, कंकाल स्नायू फायबर प्रकार परिभाषित करण्यासाठी एकाच (किंवा काही) मार्करच्या परिमाणावर अवलंबून न राहता, पारंपारिक अँटीबॉडी-आधारित पद्धतींपेक्षा फायबर प्रकार मार्करचे प्रमाण निश्चित करण्यासाठी ओमिक्स दृष्टिकोनांचा फायदा जास्त आहे. आम्ही पूरक ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटिओमिक वर्कफ्लो वापरले आणि मानवी कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये फायबर विषमतेचे ट्रान्सक्रिप्शनल आणि पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल नियमन तपासण्यासाठी निकाल एकत्रित केले. या कार्यप्रवाहामुळे आमच्या निरोगी तरुणांच्या गटाच्या व्हॅस्टस लॅटरलिसमध्ये प्रथिने पातळीवर शुद्ध 2X-प्रकार तंतू ओळखण्यात अपयश आले. हे मागील सिंगल फायबर अभ्यासांशी सुसंगत आहे ज्यात निरोगी व्हॅस्टस लॅटरलिसमध्ये <1% शुद्ध 2X तंतू आढळले, जरी भविष्यात इतर स्नायूंमध्ये याची पुष्टी केली पाहिजे. mRNA स्तरावर जवळजवळ शुद्ध 2X तंतू आणि प्रथिने स्तरावर फक्त मिश्रित 2A/2X तंतू शोधण्यामधील तफावत गोंधळात टाकणारी आहे. MYH आयसोफॉर्म mRNA अभिव्यक्ती सर्कॅडियन नाही, 67 असे सूचित करते की RNA स्तरावर शुद्ध 2X तंतूंमध्ये आपण MYH2 प्रारंभ सिग्नल "चुकवला" असण्याची शक्यता नाही. एक संभाव्य स्पष्टीकरण, जरी पूर्णपणे काल्पनिक असले तरी, MYH आयसोफॉर्ममधील प्रथिने आणि/किंवा mRNA स्थिरतेतील फरक असू शकतो. खरंच, कोणत्याही MYH आयसोफॉर्मसाठी कोणताही जलद फायबर 100% शुद्ध नाही आणि 70-90% श्रेणीतील MYH1 mRNA अभिव्यक्ती पातळी प्रथिने स्तरावर समान MYH1 आणि MYH2 विपुलतेत परिणाम करेल की नाही हे स्पष्ट नाही. तथापि, संपूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम किंवा प्रोटीओमचा विचार करताना, क्लस्टर विश्लेषण त्यांच्या अचूक MYH रचनाकडे दुर्लक्ष करून, मंद आणि जलद कंकाल स्नायू तंतूंचे प्रतिनिधित्व करणारे फक्त दोन वेगळे क्लस्टर आत्मविश्वासाने ओळखू शकते. हे सिंगल-न्यूक्लियस ट्रान्सक्रिप्टोमिक दृष्टिकोन वापरून केलेल्या विश्लेषणांशी सुसंगत आहे, जे सामान्यतः फक्त दोन वेगळे मायोन्यूक्लियर क्लस्टर ओळखतात. ६८, ६९, ७० शिवाय, जरी मागील प्रोटीओमिक अभ्यासांनी प्रकार २X तंतू ओळखले असले तरी, हे तंतू उर्वरित जलद तंतूंपासून वेगळे क्लस्टर करत नाहीत आणि MYH वर आधारित इतर तंतू प्रकारांच्या तुलनेत केवळ थोड्या प्रमाणात विपुल प्रमाणात प्रथिने दर्शवितात. १४ हे निकाल सूचित करतात की आपण २० व्या शतकाच्या सुरुवातीच्या स्नायू तंतू वर्गीकरणाच्या दृष्टिकोनाकडे परत जावे, ज्याने मानवी सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंना MYH वर आधारित तीन भिन्न वर्गांमध्ये विभागले नाही, तर त्यांच्या चयापचय आणि आकुंचनशील गुणधर्मांवर आधारित दोन क्लस्टरमध्ये विभागले. ६३
अधिक महत्त्वाचे म्हणजे, मायोफायबर विषमतेचा विचार अनेक आयामांवर केला पाहिजे. मागील "ओमिक्स" अभ्यासांनी या दिशेने निर्देश केले आहेत, असे सुचवले आहे की कंकाल स्नायू तंतू स्वतंत्र क्लस्टर्स तयार करत नाहीत तर एका सातत्यपूर्ण बाजूने व्यवस्थित केले जातात. 11, 13, 14, 64, 71 येथे, आम्ही दाखवतो की, कंकाल स्नायूंच्या आकुंचनशील आणि चयापचय गुणधर्मांमधील फरकांव्यतिरिक्त, मायोफायबर पेशी-पेशी परस्परसंवाद आणि भाषांतर यंत्रणेशी संबंधित वैशिष्ट्यांद्वारे वेगळे केले जाऊ शकतात. खरंच, आम्हाला कंकाल स्नायू तंतूंमध्ये राइबोसोम विषमते आढळली जी मंद आणि जलद फायबर प्रकारांपासून स्वतंत्रपणे विषमतेमध्ये योगदान देते. मंद आणि जलद फायबर प्रकारापासून स्वतंत्र, या महत्त्वपूर्ण मायोफायबर विषमतेचे मूळ कारण अस्पष्ट आहे, परंतु ते स्नायू फॅसिकल्समधील विशेष स्थानिक संघटनेकडे निर्देश करू शकते जे विशिष्ट शक्ती आणि भारांना अनुकूलपणे प्रतिसाद देतात, 72 स्नायू सूक्ष्म वातावरणातील इतर पेशी प्रकारांसह विशेष सेल्युलर किंवा अवयव-विशिष्ट संप्रेषण 73,74,75 किंवा वैयक्तिक मायोफायबरमधील राइबोसोम क्रियाकलापातील फरक. खरंच, RPL3 आणि RPL3L च्या पॅरालॉगस प्रतिस्थापनाद्वारे किंवा rRNA च्या 2′O-मिथिलेशनच्या पातळीवर, राइबोसोमल हेटेरोप्लाझ्मी, कंकाल स्नायूंच्या हायपरट्रॉफीशी संबंधित असल्याचे दिसून आले आहे76,77. वैयक्तिक मायोफायबर्सच्या कार्यात्मक वैशिष्ट्यीकरणासह एकत्रित केलेले बहु-ओमिक आणि स्थानिक अनुप्रयोग बहु-ओमिक पातळीवर स्नायू जीवशास्त्राची आपली समज आणखी वाढवेल78.
नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमधील सिंगल मायोफायबरच्या प्रोटीओम्सचे विश्लेषण करून, आम्ही कंकाल स्नायूंच्या क्लिनिकल पॅथोफिजियोलॉजीचे स्पष्टीकरण देण्यासाठी सिंगल मायोफायबर प्रोटीओमिक्सची उपयुक्तता, परिणामकारकता आणि उपयुक्तता देखील प्रदर्शित केली. शिवाय, आमच्या वर्कफ्लोची जागतिक प्रोटीओमिक विश्लेषणाशी तुलना करून, आम्ही हे सिद्ध करू शकलो की सिंगल मायोफायबर प्रोटीओमिक्स जागतिक ऊतक प्रोटीओमिक्स सारखीच माहिती देते आणि इंटरफायबर विषमता आणि मायोफायबर प्रकाराचा हिशेब देऊन ही खोली वाढवते. निरोगी नियंत्रणांच्या तुलनेत ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये आढळलेल्या फायबर प्रकार गुणोत्तरातील अपेक्षित (परिवर्तनीय असले तरी) फरकांव्यतिरिक्त, आम्ही MYH-मध्यस्थ फायबर प्रकार स्विचिंगपासून स्वतंत्र ऑक्सिडेटिव्ह आणि बाह्य पेशीय पुनर्निर्माण देखील पाहिले. TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये फायब्रोसिसची नोंद यापूर्वी झाली आहे.19 तथापि, आमचे विश्लेषण ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमध्ये मायोफायबर्समध्ये सारकोलेमल दुरुस्ती यंत्रणेत सहभागी असलेल्या अॅनेक्सिन्स सारख्या बाह्य पेशीय स्रावित ताण-संबंधित प्रथिनांच्या वाढीव पातळीचे प्रकटीकरण करून या निष्कर्षावर आधारित आहे.57,58,59 शेवटी, नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमध्ये मायोफायबर्समध्ये वाढलेली अॅनेक्सिन पातळी गंभीरपणे अ‍ॅट्रोफिक मायोफायबर्स दुरुस्त करण्यासाठी सेल्युलर प्रतिसाद दर्शवू शकते.
जरी हा अभ्यास मानवांचे आतापर्यंतचे सर्वात मोठे सिंगल-फायबर संपूर्ण-स्नायू-ओमिक्स विश्लेषण दर्शवित असला तरी, ते मर्यादांशिवाय नाही. आम्ही सहभागींच्या तुलनेने लहान आणि एकसंध नमुन्यापासून आणि एकाच स्नायूपासून (व्हॅस्टस लॅटरलिस) कंकाल स्नायू तंतू वेगळे केले. म्हणून, स्नायूंच्या प्रकारांमध्ये आणि स्नायूंच्या शरीरक्रियाविज्ञानाच्या टोकावर विशिष्ट फायबर लोकसंख्येचे अस्तित्व वगळणे अशक्य आहे. उदाहरणार्थ, उच्च प्रशिक्षित धावपटू आणि/किंवा ताकदवान खेळाडूंमध्ये किंवा स्नायूंच्या निष्क्रियतेच्या काळात अल्ट्राफास्ट फायबरचा उपसंच (उदा., शुद्ध 2X तंतू) उदयास येण्याची शक्यता आम्ही वगळू शकत नाही79. शिवाय, सहभागींच्या मर्यादित नमुना आकारामुळे आम्हाला फायबर विषमतेतील लिंग फरक तपासण्यापासून रोखले गेले, कारण फायबर प्रकार गुणोत्तर पुरुष आणि महिलांमध्ये भिन्न असल्याचे ज्ञात आहे. शिवाय, आम्ही समान स्नायू तंतूंवर किंवा समान सहभागींकडून नमुन्यांवर ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटिओमिक विश्लेषण करू शकलो नाही. आम्ही आणि इतर जण अल्ट्रा-लो सॅम्पल इनपुट (माइटोकॉन्ड्रियल मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांच्या तंतूंच्या विश्लेषणात दाखवल्याप्रमाणे) साध्य करण्यासाठी ओमिक्स विश्लेषणाचा वापर करून सिंगल-सेल आणि सिंगल-मायोफायबर विश्लेषणे ऑप्टिमाइझ करत राहिल्याने, सिंगल स्नायू तंतूंमध्ये मल्टी-ओमिक्स (आणि फंक्शनल) दृष्टिकोन एकत्र करण्याची संधी स्पष्ट होते.
एकंदरीत, आमचा डेटा कंकाल स्नायूंच्या विषमतेचे ट्रान्सक्रिप्शनल आणि पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल ड्रायव्हर्स ओळखतो आणि स्पष्ट करतो. विशेषतः, आम्ही असा डेटा सादर करतो जो शास्त्रीय MYH-आधारित फायबर प्रकारांच्या व्याख्येशी संबंधित कंकाल स्नायू शरीरविज्ञानातील दीर्घकालीन मतांना आव्हान देतो. आम्हाला आशा आहे की आम्ही वादविवाद पुन्हा सुरू करू आणि शेवटी कंकाल स्नायू फायबर वर्गीकरण आणि विषमतेबद्दलच्या आमच्या समजुतीवर पुनर्विचार करू.
या अभ्यासात सहभागी होण्यासाठी चौदा कॉकेशियन सहभागींनी (१२ पुरुष आणि २ महिला) स्वेच्छेने सहमती दर्शविली. हा अभ्यास घेंट युनिव्हर्सिटी हॉस्पिटलच्या नीतिमत्ता समितीने (BC-10237) मंजूर केला होता, २०१३ च्या हेलसिंकी घोषणेचे पालन केले होते आणि ClinicalTrials.gov (NCT05131555) येथे नोंदणीकृत होता. सहभागींची सामान्य वैशिष्ट्ये पूरक तक्ता १ मध्ये सादर केली आहेत. तोंडी आणि लेखी माहितीपूर्ण संमती मिळाल्यानंतर, अभ्यासात अंतिम समावेश करण्यापूर्वी सहभागींची वैद्यकीय तपासणी करण्यात आली. सहभागी तरुण (२२-४२ वर्षे), निरोगी (कोणतीही वैद्यकीय स्थिती नाही, धूम्रपानाचा इतिहास नाही) आणि मध्यम शारीरिकदृष्ट्या सक्रिय होते. पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे शारीरिक तंदुरुस्तीचे मूल्यांकन करण्यासाठी स्टेप एर्गोमीटर वापरून जास्तीत जास्त ऑक्सिजन सेवन निश्चित केले गेले. ८१
स्नायू बायोप्सीचे नमुने विश्रांतीच्या वेळी आणि उपवासाच्या स्थितीत तीन वेळा, १४ दिवसांच्या अंतराने गोळा केले गेले. हे नमुने एका मोठ्या अभ्यासाचा भाग म्हणून गोळा केले गेले असल्याने, सहभागींनी बायोप्सीच्या ४० मिनिटे आधी प्लेसिबो (लॅक्टोज), एक H1-रिसेप्टर अँटागोनिस्ट (५४० मिग्रॅ फेक्सोफेनाडाइन) किंवा एक H2-रिसेप्टर अँटागोनिस्ट (४० मिग्रॅ फॅमोटीडाइन) घेतले. आम्ही यापूर्वी दाखवून दिले आहे की हे हिस्टामाइन रिसेप्टर अँटागोनिस्ट विश्रांतीच्या कंकाल स्नायूंच्या तंदुरुस्तीवर परिणाम करत नाहीत81, आणि आमच्या गुणवत्ता नियंत्रण प्लॉटमध्ये (पूरक आकृती ३ आणि ६) स्थितीशी संबंधित कोणतेही क्लस्टरिंग आढळले नाही. प्रत्येक प्रायोगिक दिवसापूर्वी ४८ तासांसाठी प्रमाणित आहार (४१.४ किलोकॅलरी/किलो शरीराचे वजन, ५.१ ग्रॅम/किलो शरीराचे वजन कार्बोहायड्रेट, १.४ ग्रॅम/किलो शरीराचे वजन प्रथिने आणि १.६ ग्रॅम/किलो शरीराचे वजन चरबी) राखण्यात आला आणि प्रायोगिक दिवसाच्या सकाळी एक प्रमाणित नाश्ता (१.५ ग्रॅम/किलो शरीराचे वजन कार्बोहायड्रेट) घेण्यात आला. स्थानिक भूल देऊन (एपिनेफ्रिनशिवाय ०.५ मिली १% लिडोकेन), पर्कुटेनियस बर्गस्ट्रॉम एस्पिरेशन वापरून व्हॅस्टस लॅटरलिस स्नायूमधून स्नायू बायोप्सी मिळवण्यात आल्या. ८२ स्नायूंचे नमुने ताबडतोब आरएनए लेटरमध्ये एम्बेड केले गेले आणि मॅन्युअल फायबर विच्छेदन होईपर्यंत (३ दिवसांपर्यंत) ४°C वर साठवले गेले.
ताज्या वेगळ्या केलेल्या मायोफायबर बंडल एका कल्चर डिशमध्ये ताज्या आरएनएलेटर माध्यमात हस्तांतरित करण्यात आल्या. त्यानंतर स्टिरिओमायक्रोस्कोप आणि बारीक चिमट्या वापरून वैयक्तिक मायोफायबर मॅन्युअली विच्छेदन करण्यात आले. बायोप्सीच्या वेगवेगळ्या भागातून तंतू निवडण्यावर विशेष लक्ष देऊन प्रत्येक बायोप्सीमधून पंचवीस तंतू विच्छेदन करण्यात आले. विच्छेदनानंतर, अवांछित प्रथिने आणि डीएनए काढून टाकण्यासाठी प्रत्येक तंतू प्रोटीनेज के आणि डीनेज एंजाइम असलेल्या 3 μl लिसिस बफर (सिंगलशॉट सेल लिसिस किट, बायो-रॅड) मध्ये हळूवारपणे बुडवले गेले. त्यानंतर सेल लिसिस आणि प्रथिने/डीएनए काढणे थोडक्यात व्होर्टेक्सिंगद्वारे सुरू केले गेले, द्रव मायक्रोसेंट्रीफ्यूजमध्ये फिरवले गेले आणि खोलीच्या तपमानावर (१० मिनिटे) उष्मायन केले गेले. त्यानंतर लायसेटला थर्मल सायकलर (T100, बायो-रॅड) मध्ये 37°C वर 5 मिनिटांसाठी, 75°C वर 5 मिनिटांसाठी आणि नंतर पुढील प्रक्रिया होईपर्यंत लगेच -80°C वर साठवले गेले.
क्वांटसेक-पूल 3′ mRNA-Seq लायब्ररी प्रेप किट (लेक्सोजेन) वापरून 2 µl मायोफायबर लायसेटपासून इल्युमिना-सुसंगत पॉलीएडेनिलेटेड आरएनए लायब्ररी तयार करण्यात आल्या. उत्पादकाच्या मॅन्युअलमध्ये तपशीलवार पद्धती आढळू शकतात. ही प्रक्रिया रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनद्वारे फर्स्ट-स्ट्रँड सीडीएनए संश्लेषणापासून सुरू होते, ज्या दरम्यान नमुन्यांचे पूलिंग सुनिश्चित करण्यासाठी आणि डाउनस्ट्रीम प्रक्रियेदरम्यान तांत्रिक परिवर्तनशीलता कमी करण्यासाठी अद्वितीय आण्विक ओळखकर्ता (UMIs) आणि नमुना-विशिष्ट i1 बारकोड सादर केले जातात. 96 मायोफायबर्समधील सीडीएनए नंतर चुंबकीय मण्यांनी एकत्रित केले जाते आणि शुद्ध केले जाते, त्यानंतर आरएनए काढून टाकले जाते आणि यादृच्छिक प्राइमर्स वापरून दुसरे-स्ट्रँड संश्लेषण केले जाते. लायब्ररी चुंबकीय मण्यांनी शुद्ध केली जाते, पूल-विशिष्ट i5/i7 टॅग जोडले जातात आणि पीसीआर वाढवले ​​जातात. अंतिम शुद्धीकरण चरण इल्युमिना-सुसंगत लायब्ररी तयार करते. उच्च संवेदनशीलता लहान तुकडा डीएनए विश्लेषण किट (एजिलेंट टेक्नॉलॉजीज, DNF-477-0500) वापरून प्रत्येक लायब्ररी पूलची गुणवत्ता मूल्यांकन केली गेली.
क्यूबिट क्वांटिफिकेशनच्या आधारे, पूल समतुल्य सांद्रता (2 nM) वर पुढे एकत्रित केले गेले. परिणामी पूल नंतर नोव्हासेक 6000 उपकरणावर मानक मोडमध्ये नोव्हासेक S2 अभिकर्मक किट (1 × 100 न्यूक्लियोटाइड्स) वापरून 2 nM लोडिंग (4% PhiX) सह अनुक्रमित केला गेला.
आमची पाइपलाइन लेक्सोजेनच्या क्वांटसेक पूल डेटा विश्लेषण पाइपलाइनवर आधारित आहे (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis). i7/i5 इंडेक्सवर आधारित bcl2fastq2 (v2.20.0) सह डेटा प्रथम डीमल्टीप्लेक्स करण्यात आला. नंतर i1 नमुना बारकोडवर आधारित idemux (v0.1.6) सह रीड 2 डीमल्टीप्लेक्स करण्यात आला आणि umi_tools (v1.0.1) सह UMI अनुक्रम काढले गेले. नंतर लहान वाचन (<20 लांबी) किंवा केवळ अॅडॉप्टर अनुक्रम असलेले वाचन काढून टाकण्यासाठी अनेक राउंडमध्ये कटअ‍ॅडॅप्ट (v3.4) सह रीड ट्रिम केले गेले. नंतर STAR (v2.6.0c) वापरून मानवी जीनोमशी वाचन संरेखित केले गेले आणि BAM फायली SAMtools (v1.11) सह अनुक्रमित केल्या गेल्या. umi_tools (v1.0.1) वापरून डुप्लिकेट वाचन काढून टाकले गेले. शेवटी, सबरीड (v2.0.3) मधील फीचरकाउंट्स वापरून अलाइनमेंट मोजणी करण्यात आली. पाइपलाइनच्या अनेक मध्यवर्ती टप्प्यांवर फास्टक्यूसी (v0.11.9) वापरून गुणवत्ता नियंत्रण करण्यात आले.
सर्व पुढील बायोइन्फॉरमॅटिक्स प्रक्रिया आणि व्हिज्युअलायझेशन R (v4.2.3) मध्ये केले गेले, प्रामुख्याने Seurat (v4.4.0) वर्कफ्लो वापरून. 83 म्हणून, वैयक्तिक UMI मूल्ये आणि मेटाडेटा मॅट्रिक्स Seurat ऑब्जेक्ट्समध्ये रूपांतरित केले गेले. सर्व तंतूंपैकी 30% पेक्षा कमी मध्ये व्यक्त केलेले जीन्स काढून टाकण्यात आले. 1000 UMI मूल्यांच्या किमान थ्रेशोल्ड आणि 1000 शोधलेल्या जीन्सच्या आधारे कमी-गुणवत्तेचे नमुने काढून टाकण्यात आले. शेवटी, 925 तंतूंनी सर्व गुणवत्ता नियंत्रण फिल्टरिंग चरण पार केले. Seurat SCTransform v2 पद्धतीचा वापर करून UMI मूल्ये सामान्यीकृत केली गेली, 84 मध्ये सर्व 7418 शोधलेल्या वैशिष्ट्यांचा समावेश होता आणि सहभागींमधील फरक मागे घेण्यात आला. सर्व संबंधित मेटाडेटा पूरक डेटासेट 28 मध्ये आढळू शकतो.