मायोसिन हेवी चेनच्या पलीकडील मानवी सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंची विषमता

nature.com ला भेट दिल्याबद्दल धन्यवाद. तुम्ही वापरत असलेल्या ब्राउझरच्या आवृत्तीमध्ये CSS साठी मर्यादित समर्थन आहे. सर्वोत्तम अनुभवासाठी, आम्ही ब्राउझरची नवीनतम आवृत्ती वापरण्याची (किंवा इंटरनेट एक्सप्लोररमधील कंपॅटिबिलिटी मोड अक्षम करण्याची) शिफारस करतो. याव्यतिरिक्त, सतत समर्थन सुनिश्चित करण्यासाठी, ही साइट स्टाईल्स आणि जावास्क्रिप्टपासून मुक्त असेल.
कंकाल स्नायू ही एक विषम ऊती आहे जी प्रामुख्याने मायोफायब्रिल्सने बनलेली असते, ज्यांचे मानवामध्ये सामान्यतः तीन प्रकारांमध्ये वर्गीकरण केले जाते: एक "मंद" (प्रकार १) आणि दोन "जलद" (प्रकार २ए आणि २एक्स). तथापि, पारंपारिक मायोफायब्रिल प्रकारांमधील आणि त्यांच्या अंतर्गत असलेली विषमता अद्याप पूर्णपणे समजलेली नाही. आम्ही मानवी व्हॅस्टस लॅटरॅलिसमधील अनुक्रमे १०५० आणि १०३८ स्वतंत्र मायोफायब्रिल्सवर ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक पद्धती लागू केल्या. प्रोटीओमिक अभ्यासात पुरुषांचा, तर ट्रान्सक्रिप्टोमिक अभ्यासात १० पुरुष आणि २ महिलांचा समावेश होता. मायोसिन हेवी चेन आयसोफॉर्म्स व्यतिरिक्त, आम्ही मेटाबोलिक प्रथिने, रायबोसोमल प्रथिने आणि सेल्युलर जंक्शनल प्रथिने यांना बहुआयामी आंतर-मायोफायब्रिल विविधतेचे स्रोत म्हणून ओळखले. शिवाय, मंद आणि जलद तंतूंचे समूह ओळखले गेले असले तरी, आमचा डेटा सूचित करतो की प्रकार २एक्स तंतू हे बाह्यस्वरूपाने इतर जलद-आकुंचन तंतूंपासून वेगळे ओळखता येत नाहीत. याव्यतिरिक्त, नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये मायोफायबरच्या बाह्यस्वरूपाचे वर्णन करण्यासाठी मायोसिन हेवी चेन-आधारित वर्गीकरण अपुरे आहे. एकंदरीत, आमच्या डेटामधून बहुआयामी मायोफायबर विषमता दिसून येते, ज्यामध्ये भिन्नतेचे स्रोत मायोसिन हेवी चेन आयसोफॉर्मच्या पलीकडे विस्तारलेले आहेत.
पेशीय विषमता हे सर्व जैविक प्रणालींचे एक अंगभूत वैशिष्ट्य आहे, जे पेशींना ऊती आणि पेशींच्या विविध गरजा पूर्ण करण्यासाठी विशेषीकरण करण्यास अनुमती देते.¹ सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या विषमतेबद्दलचा पारंपरिक दृष्टिकोन असा होता की, मोटर न्यूरॉन्स एका मोटर युनिटमधील तंतूचा प्रकार निश्चित करतात आणि तंतूचा प्रकार (उदा., मानवांमध्ये प्रकार १, प्रकार २अ, आणि प्रकार २एक्स) मायोसिन हेवी चेन (MYH) आयसोफॉर्मच्या वैशिष्ट्यांद्वारे निर्धारित केला जातो.² हे सुरुवातीला त्यांच्या pH एटीपीएज अस्थिरतेवर³,⁴ आणि नंतर त्यांच्या MYH च्या आण्विक अभिव्यक्तीवर⁵ आधारित होते. तथापि, विविध प्रमाणात अनेक MYH सह-अभिव्यक्त करणाऱ्या "मिश्र" तंतूंच्या ओळख आणि त्यानंतरच्या स्वीकृतीमुळे, सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंना भिन्न तंतू प्रकारांऐवजी एक सलगता म्हणून अधिकाधिक पाहिले जात आहे.⁶ असे असूनही, हे क्षेत्र अजूनही मायोफायबर वर्गीकरणासाठी प्राथमिक वर्गीकारक म्हणून MYH वर मोठ्या प्रमाणावर अवलंबून आहे. हा दृष्टिकोन कदाचित सुरुवातीच्या उंदरांवरील अभ्यासाच्या मर्यादा आणि महत्त्वपूर्ण पूर्वग्रहांमुळे प्रभावित झाला असावा, ज्यांचे MYH अभिव्यक्ती प्रोफाइल आणि तंतू प्रकारांची श्रेणी मानवांपेक्षा भिन्न आहे.² ही परिस्थिती या वस्तुस्थितीमुळे आणखी गुंतागुंतीची होते की, मानवी सांगाड्याचे वेगवेगळे स्नायू विविध प्रकारची विषमता दर्शवतात. तंतु प्रकारांची श्रेणी.7 व्हॅस्टस लॅटरॅलिस हा एक मिश्र स्नायू आहे ज्यामध्ये मध्यम (आणि म्हणून प्रातिनिधिक) MYH अभिव्यक्ती प्रोफाइल आहे.7 शिवाय, त्याचे नमुने घेणे सोपे असल्यामुळे, मानवांमध्ये हा सर्वोत्तम अभ्यासलेला स्नायू आहे.
म्हणून, शक्तिशाली “ओमिक्स” साधनांचा वापर करून सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या विविधतेचा निःपक्षपाती अभ्यास करणे महत्त्वाचे आहे, परंतु सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या बहुकेंद्रकी स्वरूपामुळे ते आव्हानात्मकही आहे. तथापि, अलिकडच्या वर्षांत विविध तांत्रिक प्रगतीमुळे ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स8,9 आणि प्रोटिओमिक्स10 तंत्रज्ञानाच्या संवेदनशीलतेत क्रांती झाली आहे, ज्यामुळे सांगाड्याच्या स्नायूंचे एकल-तंतू स्तरावर विश्लेषण करणे शक्य झाले आहे. परिणामी, एकल-तंतू विविधतेचे वैशिष्ट्यीकरण आणि ऱ्हासकारक उत्तेजना व वृद्धत्वाला त्यांचा प्रतिसाद11,12,13,14,15,16,17,18 यामध्ये लक्षणीय प्रगती झाली आहे. महत्त्वाचे म्हणजे, या तांत्रिक प्रगतीचे वैद्यकीय उपयोग आहेत, ज्यामुळे रोगाशी संबंधित बिघडलेल्या नियमनाचे अधिक तपशीलवार आणि अचूक वैशिष्ट्यीकरण करणे शक्य होते. उदाहरणार्थ, सर्वात सामान्य अनुवांशिक स्नायू रोगांपैकी एक असलेल्या नेमालाइन मायोपॅथीची (MIM 605355 आणि MIM 161800) रोगशरीरक्रिया गुंतागुंतीची आणि गोंधळात टाकणारी आहे.¹⁹,²⁰ त्यामुळे, सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या नियमन-बाह्यतेचे अधिक चांगले वर्णन केल्यास या रोगाबद्दलच्या आपल्या समजात लक्षणीय प्रगती होऊ शकते.
आम्ही मानवी बायोप्सी नमुन्यांमधून हाताने वेगळे केलेल्या एकल स्केलेटल स्नायू तंतूंच्या ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक विश्लेषणासाठी पद्धती विकसित केल्या आणि त्या हजारो तंतूंवर लागू केल्या, ज्यामुळे आम्हाला मानवी स्केलेटल स्नायू तंतूंमधील पेशीय विविधतेचा अभ्यास करता आला. या कामादरम्यान, आम्ही स्नायू तंतूंच्या ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक फेनोटायपिंगची क्षमता दाखवून दिली आणि मेटाबोलिक, रायबोसोमल आणि पेशीय जंक्शनल प्रथिने हे आंतरतंतू विविधतेचे महत्त्वपूर्ण स्रोत म्हणून ओळखले. याव्यतिरिक्त, या प्रोटीओमिक कार्यप्रवाहाचा वापर करून, आम्ही एकल स्केलेटल स्नायू तंतूंमधील नेमाटोड मायोपॅथीचे नैदानिक ​​महत्त्व स्पष्ट केले, ज्यामुळे MYH वर आधारित तंतूंच्या प्रकारापासून स्वतंत्रपणे, नॉन-ऑक्सिडेटिव्ह तंतूंकडे एक समन्वित बदल दिसून आला.
मानवी सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंची विषमता तपासण्यासाठी, आम्ही एकल सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंचे ट्रान्सक्रिप्टोम आणि प्रोटिओम विश्लेषण सक्षम करण्यासाठी दोन कार्यप्रवाह विकसित केले (आकृती 1A आणि पूरक आकृती 1A). आम्ही नमुना साठवणूक आणि RNA व प्रथिनांची अखंडता जपण्यापासून ते प्रत्येक पद्धतीसाठी थ्रुपुट ऑप्टिमाइझ करण्यापर्यंत अनेक पद्धतशीर टप्पे विकसित आणि ऑप्टिमाइझ केले. ट्रान्सक्रिप्टोम विश्लेषणासाठी, रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनच्या सुरुवातीच्या टप्प्यावर नमुना-विशिष्ट आण्विक बारकोड टाकून हे साध्य केले गेले, ज्यामुळे कार्यक्षम डाउनस्ट्रीम प्रक्रियेसाठी ९६ तंतू एकत्र करणे शक्य झाले. पारंपरिक सिंगल-सेल पद्धतींच्या तुलनेत अधिक खोल सिक्वेन्सिंगमुळे (प्रति तंतू ±१ दशलक्ष रीड्स) ट्रान्सक्रिप्टोम डेटा आणखी समृद्ध झाला. २१ प्रोटिओमिक्ससाठी, आम्ही उच्च थ्रुपुट कायम ठेवत प्रोटिओमची खोली ऑप्टिमाइझ करण्यासाठी टिमस्टॉफ मास स्पेक्ट्रोमीटरवर DIA-PASEF डेटा ॲक्विझिशनसह एक लहान क्रोमॅटोग्राफिक ग्रेडियंट (२१ मिनिटे) वापरला. २२,२३ निरोगी सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंची भिन्नता तपासण्यासाठी, आम्ही १४ निरोगी प्रौढ दात्यांकडून घेतलेल्या १,०५० वैयक्तिक तंतूंचे ट्रान्सक्रिप्टोम आणि ५ निरोगी प्रौढ दात्यांकडून घेतलेल्या १,०३८ तंतूंचे प्रोटीओम यांचे वैशिष्ट्यीकरण केले (पूरक सारणी १). या शोधनिबंधात, या डेटासेटला अनुक्रमे १,०००-तंतू ट्रान्सक्रिप्टोम आणि प्रोटीओम असे संबोधले आहे. आमच्या पद्धतीनुसार १,०००-तंतू ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक विश्लेषणांमध्ये एकूण २७,२३७ ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि २,९८३ प्रथिने आढळली (आकृती १अ, पूरक डेटासेट १-२). प्रति तंतू >१,००० आढळलेली जनुके आणि ५०% वैध मूल्यांसाठी ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक डेटासेट फिल्टर केल्यानंतर, अनुक्रमे ट्रान्सक्रिप्टोम आणि प्रोटीओममधील ९२५ आणि ९७४ तंतूंसाठी पुढील बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषणे करण्यात आली. फिल्टरिंगनंतर, प्रत्येक तंतूमध्ये सरासरी ४२५७ ± १५५७ जीन्स आणि २०१५ ± २३४ प्रोटीन्स (सरासरी ± प्रमाण विचलन) आढळले, ज्यात व्यक्ती-व्यक्तींमधील तफावत मर्यादित होती (पूरक आकृत्या १बी-सी, पूरक डेटासेट ३-४). तथापि, सहभागींमध्ये एकाच व्यक्तीमधील तफावत अधिक स्पष्ट होती, जी कदाचित वेगवेगळ्या लांबीच्या आणि आडव्या छेदाच्या क्षेत्रफळाच्या तंतूंमधील आरएनए/प्रोटीनच्या उत्पादनातील फरकांमुळे असावी. बहुतेक प्रोटीन्ससाठी (>२०००), विचलन गुणांक २०% पेक्षा कमी होता (पूरक आकृती १डी). दोन्ही पद्धतींमुळे स्नायूंच्या आकुंचनासाठी महत्त्वाच्या असलेल्या (उदा., ACTA1, MYH2, MYH7, TNNT1, TNNT3) उच्च अभिव्यक्ती असलेल्या ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि प्रोटीन्सची विस्तृत गतिशील श्रेणी मिळवणे शक्य झाले (पूरक आकृत्या १ई-एफ). ओळखलेली बहुतेक वैशिष्ट्ये ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक डेटासेटमध्ये सामान्य होती (पूरक आकृती 1G), आणि या वैशिष्ट्यांची सरासरी UMI/LFQ तीव्रता बऱ्यापैकी चांगली सहसंबंधित होती (r = 0.52) (पूरक आकृती 1H).
ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि प्रोटिओमिक्स कार्यप्रवाह (BioRender.com वापरून तयार केलेला). BD MYH7, MYH2, आणि MYH1 साठी डायनॅमिक रेंज वक्र, आणि फायबर प्रकार निश्चितीसाठी गणना केलेले थ्रेशोल्ड. E, F ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि प्रोटिओमिक्स डेटासेटमधील फायबर्समध्ये MYH अभिव्यक्तीचे वितरण. G, H MYH-आधारित फायबर प्रकारानुसार रंगवलेले ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि प्रोटिओमिक्ससाठी युनिफॉर्म डायव्हर्सिटी ॲप्रोक्झिमेशन अँड प्रोजेक्शन (UMAP) आलेख. I, J ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि प्रोटिओमिक्स डेटासेटमध्ये MYH7, MYH2, आणि MYH1 अभिव्यक्ती दर्शवणारे फीचर आलेख.
आम्ही सुरुवातीला ओमिक्स डेटासेटमधील MYH अभिव्यक्तीच्या उच्च संवेदनशीलता आणि डायनॅमिक रेंजचा फायदा घेणाऱ्या एका ऑप्टिमाइझ्ड दृष्टिकोनाचा वापर करून प्रत्येक फायबरला MYH-आधारित फायबर प्रकार नियुक्त करण्याचे ठरवले. मागील अभ्यासांमध्ये वेगवेगळ्या MYHs च्या अभिव्यक्तीच्या निश्चित टक्केवारीच्या आधारावर फायबर्सना शुद्ध प्रकार 1, प्रकार 2A, प्रकार 2X किंवा मिश्र असे लेबल लावण्यासाठी अनियंत्रित थ्रेशोल्ड वापरले गेले आहेत¹¹,¹⁴,²⁴. आम्ही एक वेगळा दृष्टिकोन वापरला, ज्यामध्ये प्रत्येक फायबरच्या अभिव्यक्तीला आम्ही फायबर्सचे प्रकार निश्चित करण्यासाठी वापरलेल्या MYHs द्वारे रँक केले: MYH7, MYH2, आणि MYH1, जे अनुक्रमे प्रकार 1, प्रकार 2A, आणि प्रकार 2X फायबर्सशी संबंधित आहेत. त्यानंतर आम्ही प्रत्येक परिणामी वक्राचा खालचा इन्फ्लेक्शन पॉइंट गणिताने मोजला आणि प्रत्येक MYH साठी फायबर्सना पॉझिटिव्ह (थ्रेशोल्डच्या वर) किंवा निगेटिव्ह (थ्रेशोल्डच्या खाली) म्हणून नियुक्त करण्यासाठी तो थ्रेशोल्ड म्हणून वापरला (आकृती 1B–D). या माहितीवरून असे दिसून येते की प्रथिन पातळीच्या तुलनेत आरएनए पातळीवर MYH7 (आकृती 1B) आणि MYH2 (आकृती 1C) यांचे ऑन/ऑफ अभिव्यक्ती प्रोफाइल अधिक सुस्पष्ट आहेत. खरे तर, प्रथिन पातळीवर, फार कमी तंतूंमध्ये MYH7 ची अभिव्यक्ती नव्हती आणि कोणत्याही तंतूमध्ये 100% MYH2 अभिव्यक्ती नव्हती. पुढे, आम्ही प्रत्येक डेटासेटमधील सर्व तंतूंना MYH-आधारित तंतू प्रकार नियुक्त करण्यासाठी पूर्वनिश्चित अभिव्यक्ती मर्यादा वापरल्या. उदाहरणार्थ, MYH7+/MYH2-/MYH1- तंतूंना प्रकार 1 मध्ये, तर MYH7-/MYH2+/MYH1+ तंतूंना मिश्र प्रकार 2A/2X मध्ये नियुक्त केले गेले (संपूर्ण वर्णनासाठी पूरक सारणी 2 पहा). सर्व तंतूंना एकत्रित केल्यावर, आम्हाला आरएनए (आकृती 1E) आणि प्रथिन (आकृती 1F) या दोन्ही पातळ्यांवर MYH-आधारित तंतू प्रकारांचे वितरण लक्षणीयरीत्या समान असल्याचे दिसून आले, तर अपेक्षेप्रमाणे, MYH-आधारित तंतू प्रकारांची सापेक्ष रचना व्यक्तींनुसार भिन्न होती (पूरक आकृती 2A). बहुतेक तंतूंचे वर्गीकरण शुद्ध प्रकार १ (३४-३५%) किंवा प्रकार २अ (३६-३८%) असे करण्यात आले, तरीही लक्षणीय संख्येने मिश्र प्रकार २अ/२एक्स तंतू देखील आढळले (१६-१९%). एक लक्षणीय फरक हा आहे की शुद्ध प्रकार २एक्स तंतू केवळ आरएनए पातळीवरच आढळले, प्रथिन पातळीवर नाही. यावरून असे सूचित होते की जलद MYH अभिव्यक्तीचे नियमन किमान अंशतः प्रतिलेखनोत्तर (post-transcriptionally) होते.
आम्ही अँटीबॉडी-आधारित डॉट ब्लॉटिंगचा वापर करून आमच्या प्रोटिओमिक्स-आधारित MYH फायबर टायपिंग पद्धतीची पडताळणी केली, आणि शुद्ध प्रकार १ व प्रकार २अ फायबर्स ओळखण्यात दोन्ही पद्धतींमध्ये १००% एकमत आढळले (पूरक आकृती २ब पहा). तथापि, प्रोटिओमिक्स-आधारित पद्धत अधिक संवेदनशील, मिश्र फायबर्स ओळखण्यात अधिक कार्यक्षम आणि प्रत्येक फायबरमधील प्रत्येक MYH जनुकाचे प्रमाण मोजण्यात अधिक प्रभावी होती. ही माहिती सांगाड्याच्या स्नायूंच्या फायबर प्रकारांचे वैशिष्ट्यीकरण करण्यासाठी वस्तुनिष्ठ, अत्यंत संवेदनशील ओमिक्स-आधारित पद्धत वापरण्याची परिणामकारकता दर्शवते.
त्यानंतर आम्ही ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स आणि प्रोटिओमिक्सद्वारे प्रदान केलेल्या एकत्रित माहितीचा वापर करून, त्यांच्या संपूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम किंवा प्रोटिओमच्या आधारावर मायोफायबर्सचे वस्तुनिष्ठपणे वर्गीकरण केले. सहा मुख्य घटकांपर्यंत मिती कमी करण्यासाठी युनिफॉर्म मॅनिफोल्ड ॲप्रोक्झिमेशन अँड प्रोजेक्शन (UMAP) पद्धतीचा वापर करून (पूरक आकृत्या 3A–B), आम्ही ट्रान्सक्रिप्टोम (आकृती 1G) आणि प्रोटिओम (आकृती 1H) मधील मायोफायबरमधील भिन्नता दृश्यमान करू शकलो. विशेष म्हणजे, ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स किंवा प्रोटिओमिक्स या दोन्ही डेटासेटमध्ये मायोफायबर्सचे गट सहभागींनुसार (पूरक आकृत्या 3C–D) किंवा चाचणीच्या दिवसांनुसार (पूरक आकृती 3E) केले गेले नव्हते, यावरून असे सूचित होते की सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंमधील व्यक्ती-अंतर्गत भिन्नता ही व्यक्ती-व्यक्तींमधील भिन्नतेपेक्षा जास्त आहे. UMAP प्लॉटमध्ये, "जलद" आणि "हळू" मायोफायबर्स दर्शवणारे दोन वेगळे समूह दिसून आले (आकृत्या 1G–H). MYH7+ (मंद) मायोफायबर्स UMAP1 च्या पॉझिटिव्ह पोलवर एकत्रित झाले होते, तर MYH2+ आणि MYH1+ (जलद) मायोफायबर्स UMAP1 च्या निगेटिव्ह पोलवर एकत्रित झाले होते (आकृत्या 1I–J). तथापि, MYH अभिव्यक्तीच्या आधारावर जलद-आकुंचन फायबर प्रकारांमध्ये (म्हणजे, प्रकार 2A, प्रकार 2X, किंवा मिश्र 2A/2X) कोणताही भेद केला गेला नाही, यावरून असे सूचित होते की संपूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम किंवा प्रोटिओमचा विचार केल्यास MYH1 (आकृती 1I–J) किंवा ACTN3 किंवा MYLK2 (पूरक आकृत्या 4A–B) सारख्या इतर पारंपरिक 2X मायोफायबर मार्कर्सची अभिव्यक्ती वेगवेगळ्या मायोफायबर प्रकारांमध्ये फरक करत नाही. शिवाय, MYH2 आणि MYH7 च्या तुलनेत, फार कमी ट्रान्सक्रिप्ट्स किंवा प्रथिने MYH1 शी सकारात्मकपणे सहसंबंधित होती (पूरक आकृत्या 4C–H), यावरून असे सूचित होते की MYH1 ची विपुलता मायोफायबर ट्रान्सक्रिप्टोम/प्रोटिओमचे पूर्णपणे प्रतिबिंब दर्शवत नाही. UMAP स्तरावर तीन MYH आयसोफॉर्मच्या मिश्र अभिव्यक्तीचे मूल्यांकन करताना असेच निष्कर्ष निघाले (पूरक आकृत्या 4I–J). अशाप्रकारे, केवळ MYH प्रमाणीकरणाच्या आधारावर ट्रान्सक्रिप्ट स्तरावर 2X तंतू ओळखता येत असले तरी, संपूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम किंवा प्रोटिओमचा विचार केल्यास MYH1+ तंतू इतर वेगवान तंतूंपासून वेगळे ओळखता येत नाहीत.
MYH च्या पलीकडे स्लो फायबरच्या विविधतेचा प्राथमिक शोध म्हणून, आम्ही चार स्थापित स्लो फायबर प्रकार-विशिष्ट प्रथिनांचे मूल्यांकन केले: TPM3, TNNT1, MYL3, आणि ATP2A22. स्लो फायबर उपप्रकारांनी ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स (पूरक आकृती 5A) आणि प्रोटिओमिक्स (पूरक आकृती 5B) या दोन्हीमध्ये MYH7 सोबत उच्च, जरी परिपूर्ण नसले तरी, पिअरसन सहसंबंध दर्शवले. ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स (पूरक आकृती 5C) आणि प्रोटिओमिक्स (पूरक आकृती 5D) मध्ये, अनुक्रमे सुमारे 25% आणि 33% स्लो फायबर सर्व जीन/प्रथिन उपप्रकारांद्वारे शुद्ध स्लो फायबर म्हणून वर्गीकृत केले गेले नाहीत. म्हणून, अनेक जीन/प्रथिन उपप्रकारांवर आधारित स्लो फायबर वर्गीकरण, फायबर प्रकार-विशिष्ट म्हणून ओळखल्या जाणाऱ्या प्रथिनांसाठी देखील, अतिरिक्त गुंतागुंत निर्माण करते. यावरून असे सूचित होते की, एकाच जीन/प्रथिन कुटुंबाच्या आयसोफॉर्मवर आधारित फायबर वर्गीकरण, सांगाड्याच्या स्नायूंच्या फायबरची खरी विविधता पुरेशा प्रमाणात प्रतिबिंबित करू शकत नाही.
संपूर्ण ओमिक्स मॉडेलच्या स्तरावर मानवी सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या फेनोटाइपिक विविधतेचा अधिक शोध घेण्यासाठी, आम्ही प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस (PCA) वापरून डेटाचे निष्पक्ष परिमाणीकरण घटवले (आकृती 2A). UMAP प्लॉटप्रमाणेच, PCA स्तरावर सहभागी किंवा चाचणीच्या दिवसाचा तंतूंच्या क्लस्टरिंगवर कोणताही प्रभाव पडला नाही (पूरक आकृत्या 6A–C). दोन्ही डेटासेटमध्ये, MYH-आधारित तंतू प्रकार PC2 द्वारे स्पष्ट केला गेला, ज्यामध्ये स्लो-ट्विच प्रकार 1 तंतूंचा एक क्लस्टर आणि फास्ट-ट्विच प्रकार 2A, प्रकार 2X, आणि मिश्र 2A/2X तंतूंचा समावेश असलेला दुसरा क्लस्टर दिसून आला (आकृती 2A). दोन्ही डेटासेटमध्ये, हे दोन क्लस्टर कमी संख्येतील मिश्र प्रकार 1/2A तंतूंनी जोडलेले होते. अपेक्षेप्रमाणे, मुख्य PC ड्रायव्हर्सच्या ओव्हररिप्रेझेंटेशन विश्लेषणाने पुष्टी केली की PC2 हे आकुंचनशील आणि चयापचय सिग्नेचरद्वारे चालवले जात होते (आकृती 2B आणि पूरक आकृत्या 6D–E, पूरक डेटासेट 5–6). एकंदरीत, वेगवान क्लस्टरमध्ये संपूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोममध्ये वितरित असलेल्या तथाकथित 2X फायबर्सचा अपवाद वगळता, PC2 च्या बाजूने सतत बदल स्पष्ट करण्यासाठी MYH-आधारित फायबर प्रकार पुरेसा असल्याचे आढळले.
A. MYH वर आधारित फायबर प्रकारानुसार रंगवलेले ट्रान्सक्रिप्टोम आणि प्रोटिओम डेटासेटचे प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस (PCA) प्लॉट्स. B. PC2 आणि PC1 मधील ट्रान्सक्रिप्ट आणि प्रोटीन ड्रायव्हर्सचे एनरिचमेंट विश्लेषण. सांख्यिकीय विश्लेषण क्लस्टरप्रोफायलर पॅकेज आणि बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित पी-व्हॅल्यूज वापरून केले गेले. C, D. ट्रान्सक्रिप्टोममधील इंटरसेल्युलर ॲडेशन जीन ऑन्टोलॉजी (GO) टर्म्स आणि प्रोटिओममधील कॉस्टामेअर GO टर्म्सनुसार रंगवलेले PCA प्लॉट्स. बाण ट्रान्सक्रिप्ट आणि प्रोटीन ड्रायव्हर्स आणि त्यांच्या दिशा दर्शवतात. E, F. स्लो/फास्ट फायबर प्रकारापासून स्वतंत्र असलेले अभिव्यक्ती ग्रेडियंट्स दर्शवणारे, वैद्यकीयदृष्ट्या संबंधित वैशिष्ट्यांचे युनिफॉर्म मॅनिफोल्ड ॲप्रोक्झिमेशन अँड प्रोजेक्शन (UMAP) फीचर प्लॉट्स. G, H. ट्रान्सक्रिप्टोम आणि प्रोटिओममधील PC2 आणि PC1 ड्रायव्हर्समधील सहसंबंध.
अनपेक्षितपणे, MYH-आधारित मायोफायबर प्रकाराने केवळ दुसऱ्या क्रमांकाची सर्वाधिक परिवर्तनशीलता (PC2) स्पष्ट केली, ज्यामुळे असे सूचित होते की MYH-आधारित मायोफायबर प्रकाराशी संबंधित नसलेले इतर जैविक घटक (PC1) स्केलेटल स्नायू फायबरच्या विषमतेचे नियमन करण्यात महत्त्वाची भूमिका बजावतात. PC1 मधील शीर्ष चालकांच्या ओव्हररिप्रेझेंटेशन विश्लेषणातून असे दिसून आले की PC1 मधील परिवर्तनशीलता प्रामुख्याने ट्रान्सक्रिप्टोममधील पेशी-पेशी आसंजन आणि रायबोसोम सामग्री, आणि प्रोटिओममधील कॉस्टामेअर्स आणि रायबोसोमल प्रथिनांद्वारे निर्धारित केली जाते (आकृती 2B आणि पूरक आकृत्या 6D–E, पूरक डेटा सेट 7). स्केलेटल स्नायूमध्ये, कॉस्टामेअर्स Z-डिस्कला सार्कोलेमाशी जोडतात आणि बल प्रसारण व सिग्नलिंगमध्ये सामील असतात. पेशी-पेशी आसंजन (ट्रान्सक्रिप्टोम, आकृती 2C) आणि कॉस्टामेअर (प्रोटिओम, आकृती 2D) वैशिष्ट्ये वापरून केलेल्या एनोटेटेड PCA प्लॉट्सने PC1 मध्ये एक तीव्र लेफ्ट शिफ्ट उघड केली, जे दर्शवते की ही वैशिष्ट्ये विशिष्ट फायबरमध्ये समृद्ध आहेत.
UMAP स्तरावर मायोफायबर क्लस्टरिंगच्या अधिक तपशीलवार तपासणीतून असे दिसून आले की, बहुतेक वैशिष्ट्ये मायोफायबर सबक्लस्टर-विशिष्ट असण्याऐवजी, मायोफायबर प्रकार-निरपेक्ष MYH-आधारित अभिव्यक्ती ग्रेडियंट दर्शवतात. हे सातत्य CHCHD10 (न्यूरोमस्क्युलर रोग), SLIT3 (स्नायूंचा क्षय), CTDNEP1 (स्नायूंचा आजार) यांसारख्या रोगविषयक परिस्थितींशी संबंधित अनेक जनुकांसाठी दिसून आले (आकृती 2E). हे सातत्य प्रोटिओममध्येही दिसून आले, ज्यात न्यूरोलॉजिकल विकारांशी (UGDH), इन्सुलिन सिग्नलिंगशी (PHIP), आणि ट्रान्सक्रिप्शनशी (HIST1H2AB) संबंधित प्रथिनांचा समावेश आहे (आकृती 2F). एकत्रितपणे, हा डेटा वेगवेगळ्या मायोफायबर्समध्ये फायबर प्रकार-निरपेक्ष स्लो/फास्ट ट्विच विषमतेमधील सातत्य दर्शवतो.
विशेष म्हणजे, PC2 मधील ड्रायव्हर जीन्सनी चांगला ट्रान्सक्रिप्टोम-प्रोटिओम सहसंबंध (r = 0.663) दर्शवला (आकृती 2G), ज्यामुळे असे सूचित होते की स्लो-ट्विच आणि फास्ट-ट्विच फायबरचे प्रकार, आणि विशेषतः स्केलेटल स्नायू फायबरचे आकुंचनशील आणि चयापचय गुणधर्म, ट्रान्सक्रिप्शनली नियंत्रित केले जातात. तथापि, PC1 मधील ड्रायव्हर जीन्सनी कोणताही ट्रान्सक्रिप्टोम-प्रोटिओम सहसंबंध (r = -0.027) दर्शवला नाही (आकृती 2H), ज्यामुळे असे सूचित होते की स्लो/फास्ट-ट्विच फायबर प्रकारांशी संबंधित नसलेले बदल मोठ्या प्रमाणात पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनली नियंत्रित केले जातात. PC1 मधील बदल प्रामुख्याने रायबोसोमल जीन ऑन्टोलॉजी टर्म्सद्वारे स्पष्ट केले गेले होते, आणि रायबोसोम्स पेशीमध्ये प्रथिनांच्या भाषांतरात सक्रियपणे भाग घेऊन आणि त्यावर प्रभाव टाकून एक महत्त्वपूर्ण आणि विशेष भूमिका बजावतात,31 हे लक्षात घेता, आम्ही पुढे या अनपेक्षित रायबोसोमल विषमतेचा तपास करण्याचे ठरवले.
आम्ही प्रथम GOCC टर्म “सायटोप्लाज्मिक रायबोसोम” मधील प्रथिनांच्या सापेक्ष विपुलतेनुसार प्रोटिओमिक्स प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस प्लॉटला रंग दिला (आकृती 3A). जरी ही टर्म PC1 च्या सकारात्मक बाजूला समृद्ध असली, ज्यामुळे एक लहान ग्रेडियंट तयार होतो, तरीही रायबोसोमल प्रथिने PC1 च्या दोन्ही दिशांमध्ये विभाजनास चालना देतात (आकृती 3A). PC1 च्या नकारात्मक बाजूला समृद्ध असलेल्या रायबोसोमल प्रथिनांमध्ये RPL18, RPS18 आणि RPS13 यांचा समावेश होता (आकृती 3B), तर PC1 च्या सकारात्मक बाजूला RPL31, RPL35 आणि RPL38 (आकृती 3C) हे मुख्य चालक होते. विशेष म्हणजे, इतर ऊतींच्या तुलनेत सांगाड्याच्या स्नायूंमध्ये RPL38 आणि RPS13 मोठ्या प्रमाणात व्यक्त झाले होते (पूरक आकृती 7A). PC1 मधील ही विशिष्ट रायबोसोमल वैशिष्ट्ये ट्रान्सक्रिप्टोममध्ये आढळली नाहीत (पूरक आकृती 7B), जे पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल नियमन दर्शवते.
A. प्रोटिओममधील सायटोप्लाज्मिक रायबोसोमल जीन ऑन्टोलॉजी (GO) संज्ञांनुसार रंगवलेला प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस (PCA) प्लॉट. बाण PCA प्लॉटमधील प्रथिन-मध्यस्थी बदलाची दिशा दर्शवतात. रेषेची लांबी दिलेल्या प्रथिनासाठी प्रिन्सिपल कंपोनेंट स्कोअरशी संबंधित आहे. B, C. RPS13 आणि RPL38 साठी PCA फीचर प्लॉट्स. D. सायटोप्लाज्मिक रायबोसोमल प्रथिनांचे अनसुपरवाइज्ड हायरार्किकल क्लस्टरिंग विश्लेषण. E. 80S रायबोसोमचे संरचनात्मक मॉडेल (PDB: 4V6X), जे सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंमध्ये वेगवेगळ्या प्रमाणात असलेल्या रायबोसोमल प्रथिनांना अधोरेखित करते. F. mRNA निर्गमन वाहिनीजवळ स्थानिकीकृत, वेगवेगळ्या स्टॉइकियोमेट्रीची रायबोसोमल प्रथिने.
रायबोसोमल विषमता आणि विशेषीकरणाच्या संकल्पना पूर्वी मांडण्यात आल्या आहेत, ज्यानुसार विशिष्ट रायबोसोम उप-समूहांची उपस्थिती (रायबोसोमल विषमता) विशिष्ट mRNA ट्रान्सक्रिप्ट पूल्सच्या निवडक भाषांतराद्वारे (रायबोसोम विशेषीकरण) वेगवेगळ्या ऊतींमध्ये32 आणि पेशींमध्ये33 प्रथिन भाषांतरावर थेट प्रभाव टाकू शकते. सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंमध्ये सह-व्यक्त होणाऱ्या रायबोसोमल प्रथिनांचे उप-समूह ओळखण्यासाठी, आम्ही प्रोटिओममधील रायबोसोमल प्रथिनांचे अनियंत्रित पदानुक्रमित क्लस्टरिंग विश्लेषण केले (आकृती 3D, पूरक डेटा सेट 8). अपेक्षेप्रमाणे, MYH वर आधारित तंतूंच्या प्रकारानुसार रायबोसोमल प्रथिनांचे क्लस्टरिंग झाले नाही. तथापि, आम्ही रायबोसोमल प्रथिनांचे तीन वेगळे क्लस्टर ओळखले; पहिले क्लस्टर (ribosomal_cluster_1) हे RPL38 सह सह-नियमित आहे आणि म्हणूनच सकारात्मक PC1 प्रोफाइल असलेल्या तंतूंमध्ये त्याची अभिव्यक्ती वाढलेली असते. दुसरे क्लस्टर (ribosomal_cluster_2) हे RPS13 सह सह-नियमित आहे आणि नकारात्मक PC1 प्रोफाइल असलेल्या तंतूंमध्ये ते वाढलेले आढळते. तिसरा क्लस्टर (रिबोसोमल_क्लस्टर_3) सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंमध्ये समन्वित भिन्न अभिव्यक्ती दर्शवत नाही आणि त्याला "गाभा" सांगाड्याच्या स्नायूंचे रिबोसोमल प्रथिन मानले जाऊ शकते. रिबोसोमल क्लस्टर 1 आणि 2 या दोन्हींमध्ये अशी रिबोसोमल प्रथिने आहेत जी पूर्वी पर्यायी अनुवादाचे नियमन करतात (उदा., RPL10A, RPL38, RPS19, आणि RPS25) आणि विकासावर कार्यात्मक प्रभाव टाकतात (उदा., RPL10A, RPL38) असे दिसून आले आहे.34,35,36,37,38 पीसीए (PCA) परिणामांशी सुसंगतपणे, तंतूंमध्ये या रिबोसोमल प्रथिनांचे निरीक्षण केलेले विषम प्रतिनिधित्व देखील सातत्य दर्शवते (पूरक आकृती 7C).
रायबोसोममधील विविध रायबोसोमल प्रथिनांचे स्थान पाहण्यासाठी, आम्ही मानवी 80S रायबोसोमच्या संरचनात्मक मॉडेलचा (प्रोटीन डेटा बँक: 4V6X) वापर केला (आकृती 3E). वेगवेगळ्या रायबोसोमल क्लस्टर्समधील रायबोसोमल प्रथिने वेगळी केल्यानंतर, त्यांची स्थाने एकमेकांशी तंतोतंत जुळलेली नव्हती, यावरून असे सूचित होते की आमची पद्धत रायबोसोमच्या विशिष्ट प्रदेश/भागांसाठी समृद्धी प्रदान करण्यात अयशस्वी ठरली. तथापि, विशेष म्हणजे, क्लस्टर 2 मधील मोठ्या सबयुनिट प्रथिनांचे प्रमाण क्लस्टर 1 आणि 3 पेक्षा कमी होते (पूरक आकृती 7D). आम्ही असे निरीक्षण केले की सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंमधील बदललेल्या स्टॉइकियोमेट्रीची प्रथिने प्रामुख्याने रायबोसोमच्या पृष्ठभागावर स्थानिकीकृत होती (आकृती 3E), जे वेगवेगळ्या mRNA समूहांमधील अंतर्गत रायबोसोम प्रवेश स्थळ (IRES) घटकांशी संवाद साधण्याच्या त्यांच्या क्षमतेशी सुसंगत आहे, ज्यामुळे निवडक भाषांतराचे समन्वय साधले जाते. ४०, ४१ याव्यतिरिक्त, स्केलेटल स्नायू तंतूंमध्ये बदललेले स्टॉइकियोमेट्री असलेले अनेक प्रथिने mRNA एक्झिट टनेल (आकृती ३F) सारख्या कार्यात्मक क्षेत्रांजवळ आढळले, जे निवडकपणे विशिष्ट पेप्टाइड्सच्या ट्रान्सलेशनल एलॉन्गेशन आणि अरेस्टचे नियमन करतात. ४२ सारांश, आमचा डेटा सूचित करतो की स्केलेटल स्नायूंच्या रायबोसोमल प्रथिनांचे स्टॉइकियोमेट्री विषमता दर्शवते, ज्यामुळे स्केलेटल स्नायू तंतूंमध्ये फरक दिसून येतो.
यानंतर आम्ही फास्ट-ट्विच आणि स्लो-ट्विच फायबर सिग्नेचर ओळखण्याचे आणि त्यांच्या ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनाच्या यंत्रणांचा शोध घेण्याचे ठरवले. दोन डेटासेटमध्ये (आकृत्या 1G–H आणि 4A–B) UMAP द्वारे परिभाषित केलेल्या फास्ट-ट्विच आणि स्लो-ट्विच फायबर क्लस्टर्सची तुलना केल्यावर, ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक विश्लेषणांनी अनुक्रमे 1366 आणि 804 भिन्न प्रमाणात आढळणारी वैशिष्ट्ये ओळखली (आकृत्या 4A–B, पूरक डेटासेट 9–12). आम्हाला सार्कोमियर्स (उदा., ट्रोपोमायोसिन आणि ट्रोपोनिन), उत्तेजन-आकुंचन युग्मन (SERCA आयसोफॉर्म्स), आणि ऊर्जा चयापचय (उदा., ALDOA आणि CKB) यांच्याशी संबंधित सिग्नेचरमध्ये अपेक्षित फरक आढळले. शिवाय, प्रोटीन युबिक्विटिनेशनचे नियमन करणारे ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि प्रथिने फास्ट-ट्विच आणि स्लो-ट्विच फायबरमध्ये भिन्न प्रमाणात व्यक्त झाले होते (उदा., USP54, SH3RF2, USP28, आणि USP48) (आकृत्या 4A–B). शिवाय, सूक्ष्मजैविक प्रथिन जनुक RP11-451G4.2 (DWORF), जे पूर्वी मेंढीच्या स्नायू तंतूंच्या प्रकारांमध्ये भिन्नपणे व्यक्त होत असल्याचे दाखवले गेले आहे⁴³ आणि हृदयाच्या स्नायूंमध्ये SERCA क्रियाशीलता वाढवते⁴⁴, ते मंद गतीच्या सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंमध्ये लक्षणीयरीत्या वाढलेले आढळले (आकृती ४अ). त्याचप्रमाणे, वैयक्तिक तंतूंच्या पातळीवर, चयापचय-संबंधित लॅक्टेट डिहायड्रोजनेज आयसोफॉर्म्स (LDHA आणि LDHB, आकृती ४क आणि पूरक आकृती ८अ)⁴⁵,⁴⁶ यांसारख्या ज्ञात वैशिष्ट्यांमध्ये, तसेच पूर्वी अज्ञात असलेल्या तंतू-प्रकार-विशिष्ट वैशिष्ट्यांमध्ये (जसे की IRX3, USP54, USP28, आणि DPYSL3) लक्षणीय फरक दिसून आले (आकृती ४क). ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटिओमिक डेटासेटमधील भिन्नपणे व्यक्त होणाऱ्या वैशिष्ट्यांमध्ये लक्षणीय समानता होती (पूरक आकृती ८ब), तसेच सार्कोमियर वैशिष्ट्यांच्या अधिक स्पष्ट भिन्न अभिव्यक्तीमुळे प्रेरित झालेला फोल्ड चेंज सहसंबंधही आढळला (पूरक आकृती ८क). विशेष म्हणजे, काही सिग्नेचर (उदा. USP28, USP48, GOLGA4, AKAP13) यांनी केवळ प्रोटीओमिक स्तरावर मजबूत पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल नियमन दर्शवले आणि त्यांचे स्लो/फास्ट ट्विच फायबर प्रकार-विशिष्ट अभिव्यक्ती प्रोफाइल होते (पूरक आकृती 8C).
आकृती 1G–H मधील युनिफॉर्म मॅनिफोल्ड ॲप्रोक्झिमेशन अँड प्रोजेक्शन (UMAP) प्लॉटद्वारे ओळखलेल्या मंद आणि वेगवान क्लस्टर्सची तुलना करणारे A आणि B व्होल्कॅनो प्लॉट. रंगीत ठिपके FDR < 0.05 वर लक्षणीयरीत्या भिन्न असलेले ट्रान्सक्रिप्ट्स किंवा प्रथिने दर्शवतात, आणि गडद ठिपके लॉग चेंज > 1 वर लक्षणीयरीत्या भिन्न असलेले ट्रान्सक्रिप्ट्स किंवा प्रथिने दर्शवतात. द्विमार्गी सांख्यिकीय विश्लेषण बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित p मूल्यांसह DESeq2 वॉल्ड चाचणी (ट्रान्सक्रिप्टोमिक्स) किंवा एकाधिक तुलनांसाठी बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजनासह अनुभवजन्य बायेसियन विश्लेषणासह लिमा लिनियर मॉडेल पद्धत (प्रोटिओमिक्स) वापरून केले गेले. C मंद आणि वेगवान तंतूंमधील निवडक भिन्नपणे व्यक्त केलेल्या जनुके किंवा प्रथिनांचे सिग्नेचर प्लॉट. D लक्षणीयरीत्या भिन्नपणे व्यक्त केलेल्या ट्रान्सक्रिप्ट्स आणि प्रथिनांचे समृद्धी विश्लेषण. ओव्हरलॅपिंग व्हॅल्यूज दोन्ही डेटासेटमध्ये समृद्ध आहेत, ट्रान्सक्रिप्टोम व्हॅल्यूज केवळ ट्रान्सक्रिप्टोममध्ये समृद्ध आहेत आणि प्रोटिओम व्हॅल्यूज केवळ प्रोटिओममध्ये समृद्ध आहेत. बेन्जामिनी-होचबर्ग समायोजित पी-व्हॅल्यूजसह क्लस्टरप्रोफायलर पॅकेज वापरून सांख्यिकीय विश्लेषण केले गेले. ई. SCENIC-व्युत्पन्न रेग्युलेटर स्पेसिफिसिटी स्कोअर्स आणि फायबर प्रकारांमधील भिन्न mRNA अभिव्यक्तीच्या आधारावर SCENIC द्वारे ओळखले गेलेले फायबर प्रकार-विशिष्ट ट्रान्सक्रिप्शन घटक. एफ. स्लो आणि फास्ट फायबरमध्ये भिन्नपणे व्यक्त होणाऱ्या निवडक ट्रान्सक्रिप्शन घटकांचे प्रोफाइलिंग.
त्यानंतर आम्ही भिन्नपणे प्रतिनिधित्व केलेल्या जनुके आणि प्रथिनांचे ओव्हररिप्रेझेंटेशन विश्लेषण केले (आकृती 4D, पूरक डेटा सेट 13). दोन डेटासेटमध्ये भिन्न असलेल्या वैशिष्ट्यांसाठी पाथवे एनरिचमेंटने अपेक्षित फरक उघड केले, जसे की फॅटी ऍसिड β-ऑक्सिडेशन आणि कीटोन चयापचय प्रक्रिया (स्लो फायबर्स), मायोफिलामेंट/स्नायू आकुंचन (अनुक्रमे फास्ट आणि स्लो फायबर्स), आणि कार्बोहायड्रेट कॅटाबोलिक प्रक्रिया (फास्ट फायबर्स). फास्ट फायबर्समध्ये सेरीन/थ्रिओनिन प्रोटीन फॉस्फेटेज क्रियाकलाप देखील वाढला होता, जो नियामक आणि उत्प्रेरक फॉस्फेटेज सबयुनिट्स (PPP3CB, PPP1R3D, आणि PPP1R3A) सारख्या वैशिष्ट्यांमुळे चालविला गेला होता, जे ग्लायकोजेन चयापचय नियंत्रित करण्यासाठी ओळखले जातात (47) (पूरक आकृत्या 8D–E). जलद तंतूंमध्ये समृद्ध असलेल्या इतर मार्गांमध्ये प्रोटिओममधील प्रोसेसिंग (पी-) बॉडीज (YTHDF3, TRIM21, LSM2) (पूरक आकृती 8F), जे संभाव्यतः पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनामध्ये (48) गुंतलेले आहेत, आणि ट्रान्सक्रिप्टोममधील ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर क्रियाकलाप (SREBF1, RXRG, RORA) (पूरक आकृती 8G) यांचा समावेश होता. मंद तंतू ऑक्सिडोरेडक्टेस क्रियाकलाप (BDH1, DCXR, TXN2) (पूरक आकृती 8H), अमाइड बंधन (CPTP, PFDN2, CRYAB) (पूरक आकृती 8I), बाह्यकोशिकीय मॅट्रिक्स (CTSD, ADAMTSL4, LAMC1) (पूरक आकृती 8J), आणि रिसेप्टर-लिगँड क्रियाकलाप (FNDC5, SPX, NENF) (पूरक आकृती 8K) यांनी समृद्ध होते.
मंद/जलद स्नायू तंतू प्रकारांच्या वैशिष्ट्यांमागील ट्रान्सक्रिप्शनल नियमनाबद्दल अधिक माहिती मिळवण्यासाठी, आम्ही SCENIC49 (पूरक डेटा सेट 14) वापरून ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर एनरिचमेंट विश्लेषण केले. जलद आणि मंद स्नायू तंतूंमध्ये अनेक ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर लक्षणीयरीत्या समृद्ध झाले होते (आकृती 4E). यामध्ये MAFA सारख्या ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टरचा समावेश होता, ज्याचा संबंध पूर्वी जलद स्नायू तंतूंच्या विकासाशी जोडला गेला आहे,⁵⁰ तसेच अनेक ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर जे पूर्वी स्नायू तंतू प्रकार-विशिष्ट जनुकीय कार्यक्रमांशी संबंधित नव्हते. यांपैकी, PITX1, EGR1, आणि MYF6 हे जलद स्नायू तंतूंमध्ये सर्वाधिक समृद्ध ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर होते (आकृती 4E). याउलट, ZSCAN30 आणि EPAS1 (ज्याला HIF2A असेही ओळखले जाते) हे मंद स्नायू तंतूंमध्ये सर्वाधिक समृद्ध ट्रान्सक्रिप्शन फॅक्टर होते (आकृती 4E). याच्याशी सुसंगतपणे, जलद स्नायू तंतूंशी संबंधित UMAP प्रदेशात MAFA उच्च पातळीवर व्यक्त झाला होता, तर EPAS1 मध्ये याच्या उलट अभिव्यक्ती नमुना होता (आकृती 4F).
ज्ञात प्रथिन-संकेतन करणाऱ्या जनुकांच्या व्यतिरिक्त, असंख्य नॉन-कोडिंग आरएनए बायोटाइप्स आहेत जे मानवी विकास आणि रोगांच्या नियमनात सहभागी असू शकतात. 51, 52 ट्रान्सक्रिप्टोम डेटासेटमध्ये, अनेक नॉन-कोडिंग आरएनए फायबर प्रकाराची विशिष्टता दर्शवतात (आकृती 5A आणि पूरक डेटासेट 15), ज्यामध्ये LINC01405 चा समावेश आहे, जे स्लो फायबर्ससाठी अत्यंत विशिष्ट आहे आणि मायटोकॉन्ड्रियल मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांच्या स्नायूंमध्ये कमी झाल्याचे नोंदवले गेले आहे. 53 याउलट, lnc-ERCC5-5 जनुकाशी संबंधित असलेले RP11-255P5.3 (https://lncipedia.org/db/transcript/lnc-ERCC5-5:2) 54, फास्ट फायबर प्रकाराची विशिष्टता दर्शवते. LINC01405 (https://tinyurl.com/x5k9wj3h) आणि RP11-255P5.3 (https://tinyurl.com/29jmzder) हे दोन्ही स्केलेटल मसल स्पेसिफिसिटी (पूरक आकृत्या 9A–B) दर्शवतात आणि त्यांच्या 1 Mb जीनोमिक परिसरात कोणतेही ज्ञात आकुंचनशील जनुके नाहीत, यावरून असे सूचित होते की ते शेजारच्या आकुंचनशील जनुकांचे नियमन करण्याऐवजी फायबर प्रकारांचे नियमन करण्यात एक विशेष भूमिका बजावतात. LINC01405 आणि RP11-255P5.3 यांचे अनुक्रमे स्लो/फास्ट फायबर प्रकार-विशिष्ट एक्सप्रेशन प्रोफाइल RNAscope वापरून पुष्टी करण्यात आले (आकृत्या 5B–C).
A. स्लो-ट्विच आणि फास्ट-ट्विच स्नायू तंतूंमध्ये नॉन-कोडिंग आरएनए ट्रान्सक्रिप्ट्सचे लक्षणीय नियमन होते. B. LINC01405 आणि RP11-255P5.3 यांची अनुक्रमे स्लो-ट्विच आणि फास्ट-ट्विच तंतू प्रकारातील विशिष्टता दर्शविणाऱ्या प्रातिनिधिक आरएनएस्कोप प्रतिमा. स्केल बार = ५० μm. C. आरएनएस्कोपद्वारे निर्धारित केल्यानुसार मायोफायबर प्रकार-विशिष्ट नॉन-कोडिंग आरएनए अभिव्यक्तीचे परिमाणीकरण (n = स्वतंत्र व्यक्तींकडून घेतलेल्या ३ बायोप्सी, प्रत्येक व्यक्तीमधील फास्ट आणि स्लो स्नायू तंतूंची तुलना). सांख्यिकीय विश्लेषण टू-टेल्ड स्टुडंट्स टी-टेस्ट वापरून केले गेले. बॉक्स प्लॉटमध्ये मध्यक आणि पहिला व तिसरा चतुर्थक दर्शविले आहेत, ज्यात व्हिस्कर्स किमान आणि कमाल मूल्यांकडे निर्देशित करतात. D. डी नोवो सूक्ष्मजैविक प्रथिने ओळखण्याची कार्यप्रवाह (BioRender.com वापरून तयार केलेला). ई. सूक्ष्मजैविक प्रथिन LINC01405_ORF408:17441:17358 हे विशेषतः मंद गतीच्या सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंमध्ये व्यक्त होते (स्वतंत्र सहभागींकडून घेतलेल्या ५ बायोप्सी, ज्यात प्रत्येक सहभागीमधील जलद आणि मंद गतीच्या स्नायू तंतूंची तुलना केली आहे). सांख्यिकीय विश्लेषण लिम रेषीय मॉडेल पद्धतीचा वापर करून, अनुभवजन्य बायेसियन दृष्टिकोनासह केले गेले, आणि त्यानंतर पी-व्हॅल्यू समायोजनासह अनेक तुलनांसाठी बेंजामिनी-होचबर्ग पद्धतीचा वापर करण्यात आला. बॉक्स प्लॉटमध्ये मध्यक, पहिला आणि तिसरा चतुर्थक दर्शवले आहेत, आणि व्हिस्कर्स कमाल/किमान मूल्यांकडे निर्देशित करतात.
अलीकडे, अभ्यासातून असे दिसून आले आहे की अनेक संभाव्य नॉन-कोडिंग ट्रान्सक्रिप्ट्स हे प्रतिलेखित सूक्ष्मजैविक प्रथिनांना एन्कोड करतात, ज्यापैकी काही स्नायूंच्या कार्याचे नियमन करतात. 44, 55 संभाव्य फायबर प्रकार विशिष्टता असलेली सूक्ष्मजैविक प्रथिने ओळखण्यासाठी, आम्ही आमच्या 1000 फायबर प्रोटीओम डेटासेटमध्ये, 1000 फायबर ट्रान्सक्रिप्टोम डेटासेटमध्ये आढळलेल्या नॉन-कोडिंग ट्रान्सक्रिप्ट्सच्या (n = 305) अनुक्रमांचा समावेश असलेल्या एका सानुकूल FASTA फाईलचा वापर करून शोध घेतला (आकृती 5D). आम्ही 22 वेगवेगळ्या ट्रान्सक्रिप्ट्समधून 197 सूक्ष्मजैविक प्रथिने ओळखली, त्यापैकी 71 प्रथिने मंद आणि वेगवान स्केलेटल स्नायू फायबरमध्ये भिन्नपणे नियंत्रित केली गेली होती (पूरक आकृती 9C आणि पूरक डेटा सेट 16). LINC01405 साठी, तीन सूक्ष्मजैविक प्रथिन उत्पादने ओळखली गेली, त्यापैकी एकाने त्याच्या ट्रान्सक्रिप्टप्रमाणेच मंद फायबर विशिष्टता दर्शविली (आकृती 5E आणि पूरक आकृती 9D). अशाप्रकारे, आम्ही LINC01405 ला मंद स्केलेटल स्नायू फायबरसाठी विशिष्ट असलेल्या सूक्ष्मजैविक प्रथिनाला एन्कोड करणारे जनुक म्हणून ओळखले.
आम्ही वैयक्तिक स्नायू तंतूंच्या मोठ्या प्रमाणावरील प्रोटिओमिक वैशिष्ट्यीकरणासाठी एक सर्वसमावेशक कार्यप्रणाली विकसित केली आणि निरोगी अवस्थेत तंतूंच्या विषमतेचे नियामक ओळखले. नेमालाइन मायोपॅथीज सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या विषमतेवर कसा परिणाम करतात हे समजून घेण्यासाठी आम्ही ही कार्यप्रणाली लागू केली. नेमालाइन मायोपॅथीज हे अनुवांशिक स्नायूंचे आजार आहेत ज्यामुळे स्नायू कमकुवत होतात आणि बाधित मुलांमध्ये श्वसन त्रास, स्कोलियोसिस आणि अवयवांच्या मर्यादित हालचाली यांसारख्या अनेक गुंतागुंती दिसून येतात. 19,20 सामान्यतः, नेमालाइन मायोपॅथीजमध्ये, ॲक्टिन अल्फा 1 (ACTA1) सारख्या जनुकांमधील रोगजनक प्रकारांमुळे स्लो-ट्विच फायबर मायोफायबर रचनेचे प्राबल्य दिसून येते, जरी हा परिणाम विषम असतो. एक उल्लेखनीय अपवाद म्हणजे ट्रोपोनिन टी1 नेमालाइन मायोपॅथी (TNNT1), ज्यामध्ये फास्ट फायबर्सचे प्राबल्य असते. अशाप्रकारे, नेमालाइन मायोपॅथीजमध्ये दिसून येणाऱ्या सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या नियमन-बाह्यतेमागील विषमतेची अधिक चांगली समज, या आजारांमधील आणि मायोफायबर प्रकारांमधील गुंतागुंतीचे नाते उलगडण्यास मदत करू शकते.
निरोगी नियंत्रकांच्या तुलनेत (प्रत्येक गटात n=३), ACTA1 आणि TNNT1 जनुकांमधील उत्परिवर्तन असलेल्या नेमालाइन मायोपॅथी रुग्णांमधून वेगळे केलेल्या मायोफायबर्समध्ये लक्षणीय मायोफायबर ॲट्रोफी किंवा डिस्ट्रॉफी दिसून आली (आकृती ६अ, पूरक सारणी ३). उपलब्ध सामग्रीच्या मर्यादित प्रमाणामुळे प्रोटिओमिक विश्लेषणासाठी महत्त्वपूर्ण तांत्रिक आव्हाने निर्माण झाली. असे असूनही, आम्ही २७२ स्केलेटल मायोफायबर्समध्ये २४८५ प्रथिने शोधण्यात यशस्वी झालो. प्रत्येक फायबरमधून किमान १००० परिमाणित प्रथिने फिल्टर केल्यानंतर, २५० फायबर्स पुढील बायोइन्फॉर्मेटिक्स विश्लेषणासाठी वापरण्यात आले. फिल्टरिंगनंतर, प्रत्येक फायबरमधून सरासरी १५७३ ± ३५९ प्रथिने परिमाणित करण्यात आली (पूरक आकृती १०अ, पूरक डेटा संच १७-१८). विशेष म्हणजे, फायबरच्या आकारात लक्षणीय घट होऊनही, नेमालाइन मायोपॅथी रुग्णांच्या नमुन्यांमधील प्रोटिओमची खोली केवळ माफक प्रमाणात कमी झाली होती. शिवाय, आमच्या स्वतःच्या FASTA फाइल्स (नॉन-कोडिंग ट्रान्सक्रिप्ट्ससह) वापरून या डेटावर प्रक्रिया केल्याने आम्हाला नेमालाइन मायोपॅथी रुग्णांच्या स्केलेटल मायोफायबर्समधील पाच सूक्ष्मजैविक प्रथिने ओळखता आली (पूरक डेटा सेट 19). प्रोटिओमची डायनॅमिक रेंज लक्षणीयरीत्या व्यापक होती, आणि नियंत्रण गटातील एकूण प्रथिने मागील 1000-फायबर प्रोटिओम विश्लेषणाच्या निकालांशी चांगल्या प्रकारे जुळली (पूरक आकृती 10B–C).
अ. ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी (NM) मध्ये MYH वर आधारित फायबर ॲट्रोफी किंवा डिस्ट्रॉफी आणि विविध फायबर प्रकारांचे प्राबल्य दर्शविणाऱ्या सूक्ष्मदर्शी प्रतिमा. स्केल बार = 100 μm. ACTA1 आणि TNNT1 रुग्णांमध्ये स्टेनिंगचे पुनरुत्पादकता सुनिश्चित करण्यासाठी, प्रातिनिधिक प्रतिमा निवडण्यापूर्वी तीन रुग्णांच्या बायोप्सींना दोन ते तीन वेळा (प्रत्येक केससाठी चार सेक्शन) स्टेन केले गेले. ब. MYH वर आधारित सहभागींमधील फायबर प्रकारांचे प्रमाण. क. नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमधील आणि नियंत्रकांमधील स्केलेटल स्नायू फायबरचा प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस (PCA) प्लॉट. ड. आकृती २ मध्ये विश्लेषण केलेल्या १००० फायबरवरून निर्धारित केलेल्या PCA प्लॉटवर प्रक्षेपित केलेले नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमधील आणि नियंत्रकांमधील स्केलेटल स्नायू फायबर. उदाहरणार्थ, ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या सहभागी आणि नियंत्रकांमधील, तसेच ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या सहभागींमधील फरकांची तुलना करणारे व्होल्कॅनो प्लॉट. रंगीत वर्तुळे π < 0.05 स्तरावर लक्षणीयरीत्या भिन्न असलेली प्रथिने दर्शवतात, आणि गडद ठिपके FDR < 0.05 स्तरावर लक्षणीयरीत्या भिन्न असलेली प्रथिने दर्शवतात. सांख्यिकीय विश्लेषण लिमा लिनियर मॉडेल पद्धत आणि एम्पिरिकल बेझियन पद्धती वापरून केले गेले, त्यानंतर बेंजामिनी-होचबर्ग पद्धत वापरून एकाधिक तुलनांसाठी पी-व्हॅल्यूचे समायोजन केले गेले. एच. संपूर्ण प्रोटिओममध्ये आणि प्रकार १ व २ए तंतूंमध्ये लक्षणीयरीत्या भिन्नपणे व्यक्त झालेल्या प्रथिनांचे एनरिचमेंट विश्लेषण. सांख्यिकीय विश्लेषण क्लस्टरप्रोफायलर पॅकेज आणि बेंजामिनी-होचबर्ग समायोजित पी-व्हॅल्यू वापरून केले गेले. आय, जे. एक्स्ट्रासेल्युलर मॅट्रिक्स आणि मायटोकॉन्ड्रियल जीन ऑन्टोलॉजी (GO) संज्ञांनी रंगवलेले प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस (PCA) आलेख.
नेमालाइन मायोपॅथीमुळे सांगाड्याच्या स्नायूंमधील MYH-व्यक्त करणाऱ्या मायोफायबर प्रकारांच्या प्रमाणावर परिणाम होऊ शकतो,¹⁹,²⁰ म्हणून आम्ही सर्वप्रथम नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमध्ये आणि नियंत्रकांमध्ये MYH-व्यक्त करणाऱ्या मायोफायबर प्रकारांची तपासणी केली. आम्ही १००० मायोफायबर चाचणीसाठी पूर्वी वर्णन केलेल्या एका निष्पक्ष पद्धतीचा वापर करून मायोफायबर प्रकार निश्चित केला (पूरक आकृत्या १०D–E) आणि पुन्हा एकदा शुद्ध २X मायोफायबर ओळखण्यात अयशस्वी ठरलो (आकृती ६B). आम्हाला मायोफायबर प्रकारावर नेमालाइन मायोपॅथीचा एक विषम परिणाम दिसून आला, कारण ACTA1 उत्परिवर्तन असलेल्या दोन रुग्णांमध्ये प्रकार १ मायोफायबरचे प्रमाण वाढलेले होते, तर TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या दोन रुग्णांमध्ये प्रकार १ मायोफायबरचे प्रमाण कमी झालेले होते (आकृती ६B). खरंच, ACTA1-नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये MYH2 आणि फास्ट ट्रोपोनिन आयसोफॉर्म्स (TNNC2, TNNI2, आणि TNNT3) यांचे एक्सप्रेशन कमी झाले होते, तर TNNT1-नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये MYH7 चे एक्सप्रेशन कमी झाले होते (पूरक आकृती 11A). हे नेमालाइन मायोपॅथीमधील विषम मायोफायबर प्रकार स्विचिंगच्या पूर्वीच्या अहवालांशी सुसंगत आहे.¹⁹,²⁰ आम्ही इम्युनोहिस्टोकेमिस्ट्रीद्वारे या परिणामांची पुष्टी केली आणि आम्हाला आढळले की ACTA1-नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमध्ये टाइप 1 मायोफायबर्सचे प्राबल्य होते, तर TNNT1-नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमध्ये याच्या उलट नमुना होता (आकृती 6A).
एकल-तंतु प्रोटिओम स्तरावर, ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी रुग्णांचे सांगाड्याच्या स्नायूंचे तंतु बहुसंख्य नियंत्रण तंतूंसोबत एकत्रित झाले, ज्यात TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीचे तंतु सामान्यतः सर्वात जास्त गंभीरपणे प्रभावित होते (आकृती 6C). प्रत्येक रुग्णासाठी छद्म-फुगलेल्या तंतूंचे प्रिन्सिपल कंपोनेंट ॲनालिसिस (PCA) आलेख काढताना हे विशेषतः स्पष्ट झाले, ज्यात TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी रुग्ण 2 आणि 3 हे नियंत्रण नमुन्यांपासून सर्वात दूर असल्याचे दिसून आले (पूरक आकृती 11B, पूरक डेटा सेट 20). मायोपॅथी रुग्णांचे तंतु निरोगी तंतूंशी कसे तुलनात्मक आहेत हे अधिक चांगल्या प्रकारे समजून घेण्यासाठी, आम्ही निरोगी प्रौढ सहभागींच्या 1,000 तंतूंच्या प्रोटिओमिक विश्लेषणातून मिळालेल्या तपशीलवार माहितीचा वापर केला. आम्ही मायोपॅथी डेटासेटमधील (ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी रुग्ण आणि नियंत्रणे) तंतू 1000-तंतु प्रोटिओमिक विश्लेषणातून मिळालेल्या PCA आलेखावर प्रक्षेपित केले (आकृती 6D). नियंत्रण तंतूंमधील PC2 वरील MYH तंतू प्रकारांचे वितरण, १०००-तंतू प्रोटिओमिक विश्लेषणातून मिळालेल्या तंतू वितरणासारखेच होते. तथापि, नेमालाइन मायोपॅथीच्या रुग्णांमधील बहुतेक तंतू, त्यांच्या मूळ MYH तंतू प्रकाराची पर्वा न करता, PC2 वर खाली सरकले आणि निरोगी जलद-आकुंचन तंतूंशी जुळले. अशाप्रकारे, जरी ACTA1 नेमालाइन मायोपॅथीच्या रुग्णांमध्ये MYH-आधारित पद्धती वापरून मोजणी केल्यावर प्रकार १ तंतूंकडे बदल दिसून आला, तरी ACTA1 नेमालाइन मायोपॅथी आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी या दोन्हीमध्ये सांगाड्याच्या स्नायूंच्या तंतू प्रोटिओममध्ये जलद-आकुंचन तंतूंकडे बदल झाला.
त्यानंतर आम्ही प्रत्येक रुग्ण गटाची निरोगी नियंत्रकांशी थेट तुलना केली आणि ACTA1 व TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये अनुक्रमे २५६ आणि ५५२ भिन्नपणे व्यक्त होणारी प्रथिने ओळखली (आकृती ६E–G आणि पूरक आकृती ११C, पूरक डेटा संच २१). जीन एनरिचमेंट विश्लेषणातून मायटोकाँड्रियल प्रथिनांमध्ये एक समन्वित घट दिसून आली (आकृती ६H–I, पूरक डेटा संच २२). आश्चर्याची गोष्ट म्हणजे, ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये फायबर प्रकारांचे भिन्न प्राबल्य असूनही, ही घट MYH-आधारित फायबर प्रकारावर पूर्णपणे अवलंबून नव्हती (आकृती ६H आणि पूरक आकृत्या ११D–I, पूरक डेटा संच २३). ACTA1 किंवा TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये तीन सूक्ष्मजैविक प्रथिने देखील नियंत्रित केली गेली होती. यांपैकी दोन मायक्रोप्रोटीन्स, ENSG00000215483_TR14_ORF67 (ज्याला LINC00598 किंवा Lnc-FOXO1 असेही ओळखले जाते) आणि ENSG00000229425_TR25_ORF40 (lnc-NRIP1-2), फक्त टाईप 1 मायोफायबर्समध्ये भिन्न प्रमाणात आढळले. ENSG00000215483_TR14_ORF67 पेशी चक्र नियमनात भूमिका बजावते असे पूर्वी नोंदवले गेले आहे. 56 दुसरीकडे, निरोगी नियंत्रकांच्या तुलनेत ACTA1-नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये ENSG00000232046_TR1_ORF437 (LINC01798 शी संबंधित) टाईप 1 आणि टाईप 2A दोन्ही मायोफायबर्समध्ये वाढलेले आढळले (पूरक आकृती 12A, पूरक डेटा सेट 24). त्याउलट, रायबोसोमल प्रथिने नेमालाइन मायोपॅथीमुळे मोठ्या प्रमाणात अप्रभावित राहिली, जरी ACTA1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये RPS17 डाउनरेगुलेट झाले होते (आकृती 6E).
एनरिचमेंट विश्लेषणातून असेही दिसून आले की ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये रोगप्रतिकारक प्रणालीच्या प्रक्रियांमध्ये वाढ झाली होती, तर TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये पेशींचे आसंजन (cell adhesion) देखील वाढले होते (आकृती 6H). या बाह्यपेशीय घटकांच्या एनरिचमेंटमुळे बाह्यपेशीय मॅट्रिक्स प्रथिने PC1 आणि PC2 मधील PCA ला नकारात्मक दिशेने (म्हणजे, सर्वाधिक प्रभावित तंतूंच्या दिशेने) सरकवत होती (आकृती 6J). दोन्ही रुग्ण गटांमध्ये रोगप्रतिकारक प्रतिसाद आणि सार्कोलेमल दुरुस्ती यंत्रणेत सामील असलेल्या बाह्यपेशीय प्रथिनांची वाढलेली अभिव्यक्ती दिसून आली, जसे की ॲनेक्सिन्स (ANXA1, ANXA2, ANXA5)57,58 आणि त्यांचे आंतरक्रिया करणारे प्रथिन S100A1159 (पूरक आकृत्या 12B–C). ही प्रक्रिया पूर्वी मस्क्युलर डिस्ट्रॉफीमध्ये वाढलेली असल्याचे नोंदवले गेले आहे60, परंतु आमच्या माहितीनुसार, ती पूर्वी नेमालाइन मायोपॅथीशी जोडली गेली नव्हती. दुखापतीनंतर सार्कोलेमल दुरुस्तीसाठी आणि नव्याने तयार झालेल्या मायोसाइट्सचे मायोफायबर्ससोबत एकत्रीकरण होण्यासाठी या आण्विक यंत्रणेचे सामान्य कार्य आवश्यक आहे58,61. अशाप्रकारे, दोन्ही रुग्ण गटांमध्ये या प्रक्रियेची वाढलेली क्रियाशीलता ही मायोफायबरच्या अस्थिरतेमुळे झालेल्या दुखापतीला दिलेला एक दुरुस्तीचा प्रतिसाद असल्याचे सूचित करते.
प्रत्येक नेमालाइन मायोपॅथीचे परिणाम एकमेकांशी चांगले सहसंबंधित होते (r = 0.736) आणि त्यात वाजवी प्रमाणात समानता दिसून आली (पूरक आकृत्या 11A–B), जे दर्शवते की ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीचे प्रोटिओमवर समान परिणाम होतात. तथापि, काही प्रथिने केवळ ACTA1 किंवा TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्येच नियंत्रित केली गेली होती (पूरक आकृत्या 11A आणि C). प्रोफायब्रोटिक प्रथिन MFAP4 हे TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमधील सर्वाधिक अपरेगुलेटेड प्रथिनांपैकी एक होते, परंतु ACTA1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये ते अपरिवर्तित राहिले. SKIC8, जे HOX जीन ट्रान्सक्रिप्शनचे नियमन करण्यासाठी जबाबदार असलेल्या PAF1C कॉम्प्लेक्सचा एक घटक आहे, ते TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये डाउनरेगुलेटेड होते, परंतु ACTA1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये त्यावर कोणताही परिणाम झाला नाही (पूरक आकृती 11A). ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीची थेट तुलना केल्यावर असे दिसून आले की TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये मायटोकाँड्रियल प्रथिनांमध्ये अधिक घट आणि रोगप्रतिकारक प्रणालीच्या प्रथिनांमध्ये वाढ होते (आकृती 6G–H आणि पूरक आकृत्या 11C आणि 11H–I). ही माहिती TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीच्या तुलनेत TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये आढळलेल्या अधिक ॲट्रोफी/डिस्ट्रॉफीशी सुसंगत आहे (आकृती 6A), जे सूचित करते की TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी हे या आजाराचे अधिक गंभीर स्वरूप आहे.
नेमालाइन मायोपॅथीचे दिसून आलेले परिणाम संपूर्ण स्नायू स्तरावर टिकून राहतात की नाही याचे मूल्यांकन करण्यासाठी, आम्ही TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी रुग्णांच्या त्याच गटातील स्नायू बायोप्सीचे बल्क प्रोटीओमिक विश्लेषण केले आणि त्यांची नियंत्रकांशी (प्रत्येक गटात n=3) तुलना केली (पूरक आकृती 13A, पूरक डेटा संच 25). अपेक्षेप्रमाणे, प्रिन्सिपल कंपोनेंट विश्लेषणात नियंत्रक एकमेकांशी जवळून संबंधित होते, तर TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी रुग्णांनी एकल फायबर विश्लेषणात दिसलेल्या प्रमाणेच उच्च आंतर-नमुना भिन्नता दर्शविली (पूरक आकृती 13B). बल्क विश्लेषणाने वैयक्तिक फायबरची तुलना करून अधोरेखित केलेली भिन्नपणे व्यक्त होणारी प्रथिने (पूरक आकृती 13C, पूरक डेटा संच 26) आणि जैविक प्रक्रिया (पूरक आकृती 13D, पूरक डेटा संच 27) पुनरुत्पादित केली, परंतु वेगवेगळ्या फायबर प्रकारांमध्ये फरक करण्याची क्षमता गमावली आणि फायबरमधील विषम रोग परिणामांचा हिशोब ठेवण्यात अयशस्वी ठरले.
एकत्रितपणे, ही माहिती दर्शवते की सिंगल-मायोफायबर प्रोटिओमिक्स अशा क्लिनिकल जैविक वैशिष्ट्यांवर प्रकाश टाकू शकते, जी इम्युनोब्लॉटिंगसारख्या लक्ष्यित पद्धतींद्वारे शोधता येत नाहीत. शिवाय, ही माहिती फेनोटाइपिक अनुकूलनाचे वर्णन करण्यासाठी केवळ ॲक्टिन फायबर टायपिंग (MYH) वापरण्याच्या मर्यादा अधोरेखित करते. खरे तर, ॲक्टिन आणि ट्रोपोनिन नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये फायबर प्रकारातील बदल भिन्न असला तरी, दोन्ही नेमालाइन मायोपॅथी MYH फायबर टायपिंगला स्केलेटल मसल फायबर मेटाबॉलिझमपासून वेगळे करून अधिक जलद आणि कमी ऑक्सिडेटिव्ह मसल प्रोटिओमच्या दिशेने नेतात.
ऊतींना त्यांच्या विविध गरजा पूर्ण करण्यासाठी पेशीय विविधता अत्यंत महत्त्वाची आहे. सांगाड्याच्या स्नायूंमध्ये, याचे वर्णन अनेकदा वेगवेगळ्या प्रमाणात बल निर्मिती आणि थकवा येण्याच्या क्षमतेने वैशिष्ट्यीकृत असलेल्या तंतु प्रकारांच्या रूपात केले जाते. तथापि, हे स्पष्ट आहे की हे सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या विविधतेचा केवळ एक छोटासा भाग स्पष्ट करते, जी पूर्वीच्या विचारांपेक्षा खूपच अधिक परिवर्तनशील, गुंतागुंतीची आणि बहुआयामी आहे. तांत्रिक प्रगतीने आता सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंचे नियमन करणाऱ्या घटकांवर प्रकाश टाकला आहे. खरे तर, आमचा डेटा सूचित करतो की टाइप 2X तंतू हे सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंचा एक वेगळा उपप्रकार असू शकत नाहीत. शिवाय, आम्ही चयापचय प्रथिने, रायबोसोमल प्रथिने आणि पेशी-संबंधित प्रथिने यांना सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंच्या विविधतेचे प्रमुख निर्धारक म्हणून ओळखले. नेमाटोड मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांच्या नमुन्यांवर आमची प्रोटिओमिक कार्यप्रणाली लागू करून, आम्ही पुढे दाखवून दिले की MYH-आधारित तंतु प्रकार सांगाड्याच्या स्नायूंची विविधता पूर्णपणे प्रतिबिंबित करत नाही, विशेषतः जेव्हा प्रणाली विचलित होते. खरे तर, MYH-आधारित तंतु प्रकार कोणताही असो, नेमाटोड मायोपॅथीमुळे जलद आणि कमी ऑक्सिडेटिव्ह तंतूंकडे बदल होतो.
स्केलेटल स्नायू तंतूंचे वर्गीकरण १९व्या शतकापासून केले जात आहे. अलीकडील ओमिक्स विश्लेषणांमुळे आपल्याला विविध MYH तंतू प्रकारांचे अभिव्यक्ती प्रोफाइल आणि विविध उत्तेजनांना त्यांचे प्रतिसाद समजण्यास सुरुवात झाली आहे. येथे वर्णन केल्याप्रमाणे, स्केलेटल स्नायू तंतू प्रकार परिभाषित करण्यासाठी एका (किंवा काही) मार्करच्या प्रमाणीकरणावर अवलंबून न राहता, पारंपरिक अँटीबॉडी-आधारित पद्धतींपेक्षा तंतू प्रकार मार्करचे प्रमाणीकरण करण्यासाठी ओमिक्स पद्धतींचा अधिक संवेदनशीलतेचा फायदा आहे. आम्ही मानवी स्केलेटल स्नायू तंतूंमधील तंतू विषमतेचे ट्रान्सक्रिप्शनल आणि पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल नियमन तपासण्यासाठी पूरक ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक कार्यप्रवाह वापरले आणि त्यांचे परिणाम एकत्रित केले. या कार्यप्रवाहामुळे आमच्या निरोगी तरुण पुरुषांच्या गटातील व्हॅस्टस लॅटरॅलिसमध्ये प्रथिन स्तरावर शुद्ध 2X-प्रकारचे तंतू ओळखण्यात अपयश आले. हे पूर्वीच्या एकल तंतू अभ्यासांशी सुसंगत आहे, ज्यामध्ये निरोगी व्हॅस्टस लॅटरॅलिसमध्ये <1% शुद्ध 2X तंतू आढळले होते, तथापि भविष्यात इतर स्नायूंमध्ये याची पुष्टी करणे आवश्यक आहे. mRNA पातळीवर जवळजवळ शुद्ध 2X तंतू आढळणे आणि प्रथिन पातळीवर केवळ मिश्रित 2A/2X तंतू आढळणे, यातील तफावत गोंधळात टाकणारी आहे. MYH आयसोफॉर्म mRNA अभिव्यक्ती दैनंदिन लयबद्ध नसते,६७ ज्यामुळे RNA पातळीवर वरवर पाहता शुद्ध दिसणाऱ्या 2X तंतूंमध्ये MYH2 आरंभाचा संकेत आपल्याकडून सुटण्याची शक्यता कमी आहे. एक संभाव्य स्पष्टीकरण, जरी ते पूर्णपणे काल्पनिक असले तरी, MYH आयसोफॉर्म्समधील प्रथिन आणि/किंवा mRNA स्थिरतेतील फरक असू शकते. खरे तर, कोणताही वेगवान तंतू कोणत्याही MYH आयसोफॉर्मसाठी १००% शुद्ध नसतो, आणि ७०-९०% च्या श्रेणीतील MYH1 mRNA अभिव्यक्ती पातळीमुळे प्रथिन पातळीवर MYH1 आणि MYH2 चे प्रमाण समान राहील की नाही हे अस्पष्ट आहे. तथापि, संपूर्ण ट्रान्सक्रिप्टोम किंवा प्रोटिओमचा विचार केल्यास, क्लस्टर विश्लेषण त्यांच्या अचूक MYH रचनेची पर्वा न करता, मंद आणि वेगवान सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंचे प्रतिनिधित्व करणारे केवळ दोन वेगळे क्लस्टर्स आत्मविश्वासाने ओळखू शकते. हे एकल-केंद्रक ट्रान्सक्रिप्टोमिक दृष्टिकोन वापरून केलेल्या विश्लेषणांशी सुसंगत आहे, जे सामान्यतः केवळ दोन वेगळे मायोन्यूक्लियर क्लस्टर्स ओळखतात. ६८, ६९, ७० याव्यतिरिक्त, जरी पूर्वीच्या प्रोटिओमिक अभ्यासांनी टाइप २एक्स तंतू ओळखले असले तरी, हे तंतू उर्वरित वेगवान तंतूंपासून वेगळे गटबद्ध होत नाहीत आणि एमवायएच (MYH) वर आधारित इतर तंतूंच्या प्रकारांच्या तुलनेत केवळ कमी प्रमाणात भिन्न प्रमाणात आढळणारी प्रथिने दर्शवतात. १४ हे परिणाम सूचित करतात की आपण स्नायू तंतूंच्या वर्गीकरणाच्या २० व्या शतकाच्या सुरुवातीच्या दृष्टिकोनाकडे परत जावे, ज्यामध्ये मानवी सांगाड्याच्या स्नायू तंतूंना एमवायएच (MYH) वर आधारित तीन वेगळ्या वर्गांमध्ये नव्हे, तर त्यांच्या चयापचय आणि आकुंचनशील गुणधर्मांवर आधारित दोन गटांमध्ये विभागले होते. ६३
सर्वात महत्त्वाचे म्हणजे, मायोफायबरमधील भिन्नतेचा विचार अनेक आयामांनुसार केला पाहिजे. मागील “ओमिक्स” अभ्यासांनी या दिशेने निर्देश केला आहे, ज्यात असे सुचवले आहे की सांगाड्याच्या स्नायूंचे तंतू स्वतंत्र समूह तयार करत नाहीत, तर ते एका सलग रेषेवर रचलेले असतात. 11, 13, 14, 64, 71 येथे, आम्ही दाखवतो की, सांगाड्याच्या स्नायूंच्या आकुंचनशील आणि चयापचय गुणधर्मांमधील फरकांव्यतिरिक्त, पेशी-पेशींमधील आंतरक्रिया आणि स्थानांतरण यंत्रणांशी संबंधित वैशिष्ट्यांद्वारे मायोफायबरमध्ये फरक केला जाऊ शकतो. खरंच, आम्हाला सांगाड्याच्या स्नायूंच्या तंतूंमध्ये रायबोसोम भिन्नता आढळली, जी मंद आणि वेगवान तंतूंच्या प्रकारांपासून स्वतंत्रपणे भिन्नतेमध्ये योगदान देते. मंद आणि वेगवान तंतूंच्या प्रकारांपासून स्वतंत्र असलेल्या या लक्षणीय मायोफायबर भिन्नतेचे मूळ कारण अस्पष्ट आहे, परंतु ते स्नायूंच्या पुंजक्यांमधील विशेष अवकाशीय रचनेकडे निर्देश करू शकते, जी विशिष्ट शक्ती आणि भारांना उत्तम प्रतिसाद देते,72 स्नायूंच्या सूक्ष्म वातावरणातील इतर पेशी प्रकारांसोबत विशेष पेशीय किंवा अवयव-विशिष्ट संवाद73,74,75 किंवा वैयक्तिक मायोफायबरमधील रायबोसोम क्रियेतील फरकांकडे निर्देश करू शकते. खरंच, रायबोसोमल हेटेरोप्लाझमी, एकतर RPL3 आणि RPL3L च्या पॅरालॉगस सब्स्टिट्यूशनद्वारे किंवा rRNA च्या 2′O-मिथायलेशनच्या पातळीवर, स्केलेटल मसल हायपरट्रॉफीशी संबंधित असल्याचे दिसून आले आहे76,77. मल्टी-ओमिक आणि स्पॅशियल ॲप्लिकेशन्स, वैयक्तिक मायोफायबर्सच्या कार्यात्मक वैशिष्ट्यांसह एकत्रितपणे, मल्टी-ओमिक स्तरावर स्नायू जीवशास्त्राबद्दलची आपली समज आणखी वाढवतील78.
नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांमधील एकल मायोफायबरच्या प्रोटीओमचे विश्लेषण करून, आम्ही सांगाड्याच्या स्नायूंच्या क्लिनिकल पॅथोफिजियोलॉजीवर प्रकाश टाकण्यासाठी एकल मायोफायबर प्रोटीओमिक्सची उपयुक्तता, परिणामकारकता आणि लागूता देखील दाखवून दिली. शिवाय, आमच्या कार्यप्रवाहाची जागतिक प्रोटीओमिक विश्लेषणाशी तुलना करून, आम्ही हे दाखवू शकलो की एकल मायोफायबर प्रोटीओमिक्स जागतिक टिश्यू प्रोटीओमिक्सइतकीच सखोल माहिती देते आणि इंटरफायबर हेटेरोजिनिटी व मायोफायबर प्रकार विचारात घेऊन ही सखोलता वाढवते. निरोगी नियंत्रकांच्या तुलनेत ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये फायबर प्रकाराच्या गुणोत्तरात अपेक्षित (जरी बदलणारे असले तरी) फरक दिसून आले,¹⁹ त्याव्यतिरिक्त, आम्ही MYH-मध्यस्थ फायबर प्रकार स्विचिंगपासून स्वतंत्र असे ऑक्सिडेटिव्ह आणि एक्स्ट्रासेल्युलर रिमॉडेलिंग देखील पाहिले. TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथीमध्ये फायब्रोसिस झाल्याचे यापूर्वी नोंदवले गेले आहे.¹⁹ तथापि, आमचे विश्लेषण या निष्कर्षाला पुढे नेत, ACTA1 आणि TNNT1 नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांच्या मायोफायबर्समध्ये, सार्कोलेमल दुरुस्ती यंत्रणेत सामील असलेल्या ॲनेक्सिनसारख्या, बाह्यकोशिकीय स्रावित तणाव-संबंधित प्रथिनांची वाढलेली पातळी देखील उघड करते.⁵⁷,⁵⁵⁹ निष्कर्षतः, नेमालाइन मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांच्या मायोफायबर्समधील ॲनेक्सिनची वाढलेली पातळी ही गंभीरपणे ॲट्रॉफिक झालेल्या मायोफायबर्सच्या दुरुस्तीसाठी एक पेशीय प्रतिसाद दर्शवू शकते.
जरी हा अभ्यास आजपर्यंतचा मानवांवरील सर्वात मोठा एकल-तंतु संपूर्ण-स्नायू-ओमिक्स विश्लेषण असला तरी, तो मर्यादांशिवाय नाही. आम्ही सहभागींच्या तुलनेने लहान आणि एकजिनसी नमुन्यातून आणि एकाच स्नायूमधून (व्हॅस्टस लॅटरॅलिस) सांगाड्याच्या स्नायूंचे तंतू वेगळे केले. त्यामुळे, विविध स्नायू प्रकारांमध्ये आणि स्नायू शरीरविज्ञानाच्या टोकाच्या स्थितींमध्ये विशिष्ट तंतूंच्या समूहांचे अस्तित्व नाकारणे अशक्य आहे. उदाहरणार्थ, आम्ही अत्यंत प्रशिक्षित धावपटूंमध्ये आणि/किंवा ताकदवान खेळाडूंमध्ये७९ किंवा स्नायूंच्या निष्क्रियतेच्या काळात६६,८० अतिवेगवान तंतूंचा एक उपसंच (उदा., शुद्ध २X तंतू) उदयास येण्याची शक्यता नाकारू शकत नाही. शिवाय, सहभागींच्या मर्यादित नमुना आकारामुळे आम्हाला तंतूंच्या विविधतेमधील लैंगिक फरक तपासता आले नाहीत, कारण पुरुष आणि स्त्रियांमध्ये तंतूंच्या प्रकारांचे प्रमाण भिन्न असते हे ज्ञात आहे. याव्यतिरिक्त, आम्ही एकाच स्नायू तंतूंवर किंवा एकाच सहभागींच्या नमुन्यांवर ट्रान्सक्रिप्टोमिक आणि प्रोटीओमिक विश्लेषण करू शकलो नाही. आम्ही आणि इतर जण ओमिक्स विश्लेषणाचा वापर करून एकल-पेशी आणि एकल-स्नायू तंतू विश्लेषणांना अधिक कार्यक्षम बनवत असताना (जसे येथे मायटोकाँड्रियल मायोपॅथी असलेल्या रुग्णांच्या तंतूंच्या विश्लेषणात दाखवले आहे), एकाच स्नायू तंतूमध्ये बहु-ओमिक्स (आणि कार्यात्मक) पद्धती एकत्र करण्याची संधी स्पष्ट होते.
एकंदरीत, आमचा डेटा सांगाड्याच्या स्नायूंच्या विविधतेमागील ट्रान्सक्रिप्शनल आणि पोस्ट-ट्रान्सक्रिप्शनल घटकांना ओळखतो आणि त्यांचे स्पष्टीकरण देतो. विशेषतः, आम्ही असा डेटा सादर करत आहोत जो फायबर प्रकारांच्या शास्त्रीय MYH-आधारित व्याख्येशी संबंधित, सांगाड्याच्या स्नायूंच्या शरीरविज्ञानातील एका दीर्घकाळ चालत आलेल्या सिद्धांताला आव्हान देतो. आम्हाला आशा आहे की यामुळे या चर्चेला पुन्हा चालना मिळेल आणि अंतिमतः सांगाड्याच्या स्नायूंच्या फायबरचे वर्गीकरण आणि विविधतेबद्दलच्या आपल्या समजावर पुनर्विचार केला जाईल.
चौदा कॉकेशियन सहभागी (१२ पुरुष आणि २ महिला) या अभ्यासात स्वेच्छेने सहभागी होण्यास सहमत झाले. या अभ्यासाला घेंट युनिव्हर्सिटी हॉस्पिटलच्या नीती समितीने (BC-10237) मान्यता दिली होती, तो २०१३ च्या हेलसिंकी घोषणेनुसार होता आणि ClinicalTrials.gov (NCT05131555) येथे नोंदणीकृत होता. सहभागींची सामान्य वैशिष्ट्ये परिशिष्ट सारणी १ मध्ये सादर केली आहेत. तोंडी आणि लेखी माहितीपूर्ण संमती मिळाल्यानंतर, अभ्यासात अंतिम समावेश करण्यापूर्वी सहभागींची वैद्यकीय तपासणी करण्यात आली. सहभागी तरुण (२२-४२ वर्षे), निरोगी (कोणतीही वैद्यकीय समस्या नाही, धूम्रपानाचा इतिहास नाही) आणि मध्यम शारीरिकदृष्ट्या सक्रिय होते. पूर्वी वर्णन केल्याप्रमाणे शारीरिक तंदुरुस्तीचे मूल्यांकन करण्यासाठी स्टेप एर्गोमीटर वापरून कमाल ऑक्सिजन ग्रहण निश्चित केले गेले. 81
स्नायू बायोप्सीचे नमुने विश्रांतीच्या स्थितीत आणि उपाशीपोटी १४ दिवसांच्या अंतराने तीन वेळा गोळा करण्यात आले. हे नमुने एका मोठ्या अभ्यासाचा भाग म्हणून गोळा केले जात असल्यामुळे, सहभागींनी बायोप्सीच्या ४० मिनिटे आधी प्लेसिबो (लॅक्टोज), एक H1-रिसेप्टर अँटागोनिस्ट (५४० मिग्रॅ फेक्सोफेनाडाइन), किंवा एक H2-रिसेप्टर अँटागोनिस्ट (४० मिग्रॅ फॅमोटिडाइन) यांचे सेवन केले. आम्ही पूर्वी दाखवून दिले आहे की हे हिस्टामाइन रिसेप्टर अँटागोनिस्ट विश्रांतीच्या स्थितीतील सांगाड्याच्या स्नायूंच्या तंदुरुस्तीवर परिणाम करत नाहीत⁸¹, आणि आमच्या गुणवत्ता नियंत्रण आलेखांमध्ये (पूरक आकृत्या ३ आणि ६) स्थिती-संबंधित कोणतेही क्लस्टरिंग दिसून आले नाही. प्रत्येक प्रायोगिक दिवसाच्या ४८ तास आधी एक प्रमाणित आहार (४१.४ किलोकॅलरी/किलो शारीरिक वजन, ५.१ ग्रॅम/किलो शारीरिक वजन कर्बोदके, १.४ ग्रॅम/किलो शारीरिक वजन प्रथिने, आणि १.६ ग्रॅम/किलो शारीरिक वजन चरबी) पाळण्यात आला, आणि प्रायोगिक दिवसाच्या सकाळी एक प्रमाणित नाश्ता (१.५ ग्रॅम/किलो शारीरिक वजन कर्बोदके) सेवन करण्यात आला. स्थानिक भूल देऊन (एपिनेफ्रिनशिवाय 0.5 मिली 1% लिडोकेन), त्वचेतून बर्गस्ट्रॉम ॲस्पिरेशन वापरून व्हॅस्टस लॅटरॅलिस स्नायूचे बायोप्सी नमुने घेण्यात आले.82 स्नायूचे नमुने त्वरित RNAlater मध्ये एम्बेड केले गेले आणि हाताने फायबर वेगळे करेपर्यंत (3 दिवसांपर्यंत) 4°C तापमानावर साठवले गेले.
नुकतेच वेगळे केलेले मायोफायबरचे गठ्ठे एका कल्चर डिशमधील ताज्या RNAlater माध्यमात स्थानांतरित करण्यात आले. त्यानंतर, स्टिरिओमायक्रोस्कोप आणि बारीक चिमट्याच्या साहाय्याने प्रत्येक मायोफायबर हाताने वेगळे करण्यात आले. प्रत्येक बायोप्सीमधून पंचवीस फायबर वेगळे करण्यात आले, आणि बायोप्सीच्या वेगवेगळ्या भागांतील फायबर निवडण्यावर विशेष लक्ष देण्यात आले. फायबर वेगळे केल्यानंतर, नको असलेले प्रथिने आणि डीएनए काढून टाकण्यासाठी, प्रत्येक फायबरला प्रोटीनेज के (proteinase K) आणि डीएनएज (DNase) एन्झाइम्स असलेल्या ३ μl लायसिस बफरमध्ये (सिंगलशॉट सेल लायसिस किट, बायो-रॅड) हळुवारपणे बुडवण्यात आले. त्यानंतर, थोड्या वेळासाठी व्हॉर्टेक्सिंग करून, मायक्रोसेंट्रीफ्यूजमध्ये द्रव फिरवून आणि खोलीच्या तापमानावर (१० मिनिटे) ठेवून पेशींचे विघटन (सेल लायसिस) आणि प्रथिने/डीएनए काढून टाकण्याची प्रक्रिया सुरू करण्यात आली. त्यानंतर, लायसेटला थर्मल सायक्लरमध्ये (T100, बायो-रॅड) ३७°C वर ५ मिनिटे, ७५°C वर ५ मिनिटे ठेवण्यात आले आणि पुढील प्रक्रियेपर्यंत लगेचच -८०°C वर साठवून ठेवण्यात आले.
क्वांटसेक-पूल ३' एमआरएनए-सेक लायब्ररी प्रेप किट (लेक्सोजेन) वापरून २ मायक्रोलिटर मायोफायबर लायसेटपासून इल्युमिना-सुसंगत पॉलीॲडेनिलेटेड आरएनए लायब्ररी तयार करण्यात आल्या. सविस्तर पद्धती उत्पादकाच्या मॅन्युअलमध्ये आढळतील. ही प्रक्रिया रिव्हर्स ट्रान्सक्रिप्शनद्वारे फर्स्ट-स्ट्रँड सीडीएनए संश्लेषणाने सुरू होते, ज्या दरम्यान नमुन्यांचे पूलिंग सुनिश्चित करण्यासाठी आणि डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग दरम्यान तांत्रिक परिवर्तनशीलता कमी करण्यासाठी युनिक मॉलिक्युलर आयडेंटिफायर्स (यूएमआय) आणि नमुना-विशिष्ट आय१ बारकोड समाविष्ट केले जातात. त्यानंतर ९६ मायोफायबर्समधील सीडीएनए पूल केले जाते आणि मॅग्नेटिक बीड्सने शुद्ध केले जाते, ज्यानंतर आरएनए काढून टाकला जातो आणि रँडम प्रायमर्स वापरून सेकंड-स्ट्रँड संश्लेषण केले जाते. लायब्ररी मॅग्नेटिक बीड्सने शुद्ध केली जाते, पूल-विशिष्ट आय५/आय७ टॅग जोडले जातात आणि पीसीआरद्वारे प्रवर्धित केली जाते. अंतिम शुद्धीकरणाच्या टप्प्यातून इल्युमिना-सुसंगत लायब्ररी तयार होतात. प्रत्येक लायब्ररी पूलच्या गुणवत्तेचे मूल्यांकन हाय सेन्सिटिव्हिटी स्मॉल फ्रॅगमेंट डीएनए ॲनालिसिस किट (ॲजिलेंट टेक्नॉलॉजीज, डीएनएफ-४७७-०५००) वापरून केले गेले.
क्यूबिट क्वांटिफिकेशनच्या आधारावर, पूल्सना पुढे सममोलर सांद्रतेवर (2 nM) एकत्र केले गेले. परिणामी पूलला नंतर नोव्हासेक 6000 इन्स्ट्रुमेंटवर स्टँडर्ड मोडमध्ये नोव्हासेक S2 रिएजंट किट (1 × 100 न्यूक्लिओटाइड्स) वापरून 2 nM लोडिंग (4% PhiX) सह सिक्वेन्स केले गेले.
आमची पाइपलाइन लेक्सोजेनच्या क्वांटसेक पूल डेटा विश्लेषण पाइपलाइनवर (https://github.com/Lexogen-Tools/quantseqpool_analysis) आधारित आहे. सर्वप्रथम, i7/i5 इंडेक्सच्या आधारावर bcl2fastq2 (v2.20.0) वापरून डेटाचे डिमल्टिप्लेक्सिंग करण्यात आले. त्यानंतर, i1 सॅम्पल बारकोडच्या आधारावर idemux (v0.1.6) वापरून रीड 2 चे डिमल्टिप्लेक्सिंग करण्यात आले आणि umi_tools (v1.0.1) वापरून UMI सिक्वेन्सेस काढण्यात आले. त्यानंतर, लहान रीड्स (<20 लांबीचे) किंवा केवळ अडॅप्टर सिक्वेन्सेस असलेले रीड्स काढून टाकण्यासाठी cutadapt (v3.4) वापरून अनेक फेऱ्यांमध्ये रीड्स ट्रिम करण्यात आले. त्यानंतर, STAR (v2.6.0c) वापरून रीड्स मानवी जीनोमशी अलाइन करण्यात आले आणि SAMtools (v1.11) वापरून BAM फाइल्स इंडेक्स करण्यात आल्या. umi_tools (v1.0.1) वापरून डुप्लिकेट रीड्स काढून टाकण्यात आले. शेवटी, Subread (v2.0.3) मधील featureCounts वापरून अलाइनमेंटची गणना करण्यात आली. पाइपलाइनच्या अनेक मध्यवर्ती टप्प्यांवर FastQC (v0.11.9) वापरून गुणवत्ता नियंत्रण केले गेले.
पुढील सर्व बायोइन्फॉर्मेटिक्स प्रक्रिया आणि व्हिज्युअलायझेशन R (v4.2.3) मध्ये, प्रामुख्याने Seurat (v4.4.0) वर्कफ्लो वापरून केले गेले. 83 त्यामुळे, वैयक्तिक UMI मूल्ये आणि मेटाडेटा मॅट्रिक्स Seurat ऑब्जेक्ट्समध्ये रूपांतरित केले गेले. सर्व फायबर्सपैकी 30% पेक्षा कमी फायबर्समध्ये व्यक्त होणारे जीन्स काढून टाकण्यात आले. 1000 UMI मूल्ये आणि 1000 शोधलेल्या जीन्सच्या किमान मर्यादेच्या आधारावर कमी-गुणवत्तेचे नमुने काढून टाकण्यात आले. अखेरीस, 925 फायबर्स सर्व गुणवत्ता नियंत्रण फिल्टरिंग टप्प्यांमध्ये यशस्वी झाले. सर्व 7418 शोधलेल्या फीचर्ससह, Seurat SCTransform v2 पद्धत वापरून UMI मूल्यांचे सामान्यीकरण केले गेले, 84 आणि सहभागींमधील फरक काढून टाकण्यात आले. सर्व संबंधित मेटाडेटा पूरक डेटासेट 28 मध्ये आढळू शकतो.